2008猪早期孤雌激活胚不同发育阶段差异基因2.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（８）：６２～６８ 猪早期孤雌激活胚不同发育阶段差异基因 表达的研究 １，２ ２ １ １，２ ２ 胡　婕 　苗向阳 　王希彪 　冯浩咏 　刘羞菲 （１东北农业大学动物科技学院　哈尔滨　１５００３０　２中国农业科学院北京畜牧兽医研究所　北京　１０００９４） 摘要　收集２细胞、４细胞、８１６细胞时期的猪孤雌激活胚，采用ＳＰＥＤＤＲＴＰＣＲ方法挑选不同时 期的差异表达产物，通过反向Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交去除假阳性的条带。将阳性条带克隆入Ｔ载体中，经 过ＰＣＲ鉴定后挑选其中的阳性克隆进行测序，筛选了８个代表不同时期表达差异的ｃＤＮＡ片段， 编号为ＤＤ１ＤＤ８。经过与ＧｅｎＢａｎｋ中的数据进行同源性分析，发现其中ＤＤ１和ＤＤ２没有相似的 数据，提交数据库获得ＧｅｎＢａｎｋ登录号（ＥＵ５４５１５８，ＥＵ５４５１５９）；其余的ＤＤ３ＤＤ８发现了相似性 较高的数据，但除ＤＤ３外均无基因功能说明需要进行进一步的研究。 关键词　猪　孤雌胚胎　发育相关基因　ＳＰＥＤＤＲＴＰＣＲ 中图分类号　Ｑ７８６ 　　在哺乳动物发育生物学研究中，卵母细胞的孤雌 术 （ｓｉｎｇｌｅｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎｅｍｂｒｙｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｄｉｓｐｌａｙ 激活是一种重要的研究方式。一方面，孤雌活化卵只 ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＳＰＥＤＤＲＴ 含有母源的遗传信息，便于研究雌性基因组在个体发 ［１０］ ＰＣＲ） 对孤雌激活的２细胞、４细胞、８细胞期的胚胎 育过程中的作用，有助于了解早期胚胎发育的相关基 进行分析研究，以寻找发育过程中的差异基因，探讨孤 因和机理；另一方面，进行显微受精和细胞核移植研究 雌激活胚发育的分子基础，更好地了解精卵结合过程 时，卵母细胞所移入的核物质的复制及其一系列相关 中母源基因所起的作用。 的发育启动过程完全依赖于卵母细胞的激活，因此，研 究卵母细胞的激活及孤雌胚胎的发育过程有助于完善 １　材料与方法 细胞核移植以及显微受精技术；再者可以利用孤雌生 １．１　材　料 殖产生的特殊单倍体或者纯合的双倍体建立专门的孤 １．１．１　卵巢的采集及卵母细胞的筛选　试验所用卵 雌动物品系，从而加速家畜育种的进程［１～３］。 巢取自屠宰场。将剪下来的猪卵巢在３７℃的条件下２ｈ 　　有研究发现卵母细胞经过激活后所形成的孤雌胚 内用加了双抗的生理盐水带回实验室，用等温的加双 的发育能力比较差，其卵裂率和囊胚发育率均低于正 抗的生理盐水冲洗２～３遍，采用刺破法将卵巢表面２ 常发育的胚胎［４～７］，因此，提高胚胎发育率是现阶段孤 ～６ｍｍ的卵泡刺破，沉淀卵泡液，静置后在体式显微镜 雌激活胚胎研究的主要方向之一［７～９］，而目前有关孤雌 下迅速进行检卵、挑卵。 胚发育分子机制的报道还比较少。 １．１．２　卵母细胞的成熟培养　 卵母细胞的成熟培养 　　为了解猪早期胚胎发育相关基因表达的分子机 采用微滴法。用冲卵液将挑选出的卵母细胞清洗２～３ 制，本研究运用单个植入前胚胎的ｍＲＮＡ差异显示技