《TTF-1启动子调控microRNA-7真核表达载体的构建》.pdfVIP

第37卷 第3期 2014年6月 遵 义 医 学 院 学 报 VO1．37 No．3 JournalofZunyiMedicalUniversity Jun．2014 TTF一1启动子调控 microRNA一7真核表达载体的构建 陈 超 ，赵娟娟 ，胡 艳 ，郭萌萌 ，陶弋婧 ，周 涯 ，秦娜琳 ，郑 静 ，徐 林 (1．遵义医学院免疫学教研室暨贵州省免疫学研究生创新基地，贵州遵义 563099；2．遵义医学院 医学物理学教研室，贵 州 遵义 563099) [摘 要]目的 构建甲状腺转录因子(rITrF一1)启动子调控miR一7表达的真核表达载体 ，并观察其表达miR一7对人肺癌 细胞体外生长的影响。方法抽提人肺癌95D细胞基因组DNA，PCR分别扩增TTF一1启动子序列 (promoter)和miR一7前 体序列，纯化产物分别经KpnI／MulI双酶切和MulI／HindII双酶切，克隆入PGI_3一basic一载体，构建pGL3一basic—TTF一 1一promoter—miR一7真核表达载体 (命名为P—T—miR一7)；将 P—T—miR一7真核载体体外瞬时转染人肺癌95D细胞 ， Real—timePCR探针法检测细胞中miR一7的表达水平；CCK一8实验和克隆形成实验检测细胞增殖情况；划痕实验检测转 染后细胞的体外迁移情况。结果经酶切和测序鉴定成功构建 1TrF一1启动子调控的miR一7真核表达载体P—T—miR一7： 转染后72h，与对照相比，P—T—miR一7转染组中miR一7的表达水平增加约2．5倍 (P0．05)；CCK一8实验和克隆形成 实验显示 ，P—T—miR一7转染组中95D细胞的增殖能力明显下降(P0．05)；划痕实验进一步显示，细胞的体外迁移能力 也显著削弱(P0．05)。结论 成功构建 1TrF一1启动子调控的miR一7真核表达载体，这为后续肺癌基因治疗策略开发提 供重要前期实验基础。 [关键词]肺癌；甲状腺转录因子；微小RNA一7；真核表达 [中图法分类号]R734．2 [文献标志码]A [文章编号]1000-2715(2014)03-0263-08 ConstructionofeukaryoticexpressionvectorTTF——1promoterregulationmi— croRNA 一7 ChenChao，ZhaoJuanjuan，HuYah，GuoMengmeng，Tao ，ZhouYa，Qin Nalin ，Zheng ，XuLin (1．DepartmentofImmunology，ZunyiMedicalUniversity，ZunyiGuizhou563099，China；2．Departmentof MedicalPhysics，ZunyiMedicalUniversity，ZunyiGuizhou563099，China) [Abstract]ObjectiveToconstructaeukaryoticexpressionvectorofTTF一1promoterregulationmiR一7and studyitseffectonthegrowthofhumanlungcancercellsinvitro．M ethodsPri—miR 一7and 丌F一1promoter wasamplifiedfrom humanlungcancer95D cellgenomicDNA，Purificationproductsweredigestedwithrestricted enzymeKpnIandMulIorMulIandHindIIIrespectivelyandthensequentlysubclonededintoPGL3——basic vector．Therecombinantplasmid(termedasP—T—miR一7)wastransientlytransfectedintothelungcancerline 95D cells．After72h，theexpressionofmaturenfiR一7wasdetemr inedbyReal—timePCR assay．Thegrowth ofcellswasdetectedbyCCK——8assayandcloneformationas