第七章重组体克隆的筛选和鉴定-精.pptVIP

第七章 重组体克隆的筛选和鉴定 第一节 利用遗传标记的表型特征筛选 如：pBR322质粒上有两个抗菌素性基因: Tetr和Ampr。  2. pBR322抗菌素标记选择 3. 选择过程： （2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程 二、营养缺陷型筛选法 如：亮氨酸（Leu)缺陷菌在无Leu培养基中不生长， 当含Leu外源基因在此缺陷菌中表达时可生长，以此来筛选阳性克隆。 第二节 根据重组子的结构特征筛选 二、限制性酶切图谱法 筛选过程 三、PCR扩增检测法 四、 核酸分子杂交检测法 2、菌落噬菌斑原位杂交筛选 Southern blot 筛选结果 4. Northern blotting 第三节 免疫化学检测法 2. 放射性抗体检测法过程 3. Broome-Gilbert双位点检测法 二、免疫沉淀检测法 2. ELISA检测的一般步骤 （2）一抗结合 （3）二抗结合 （4）显色反应 （5）比色 3.ELISA的局限性 四、免疫印迹（western blotting）法 ② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）： ③蛋白质电泳的分子量标准 ④凝胶中的蛋白质染色： （2）Western blotting Western装置 ② Blotting ③ Blotting过程 ④结果 （1）固定样品 将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。 （孔底） 加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体。 一抗 加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。 二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）。 二抗 加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。 在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。 有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑。 最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）。 1.原理： 在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。 （1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。 ① SDS: （SDS）： （Polyacrylamide gel electrophoresis） 在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，移动的速率主要取决于其分子量大小（链的长短），从而把不同分子量的肽链分开。 电泳buffer 电泳buffer 已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。 商品化供应 Da 道尔顿(质量单位, 等于一氧原子质量的十六分之一。 一克约为6×1023道尔顿 Dalton 考马斯亮蓝： 灵敏度底、只能检出0.3-1μg/带，但可褪色回收。 硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。 2）转到膜上进行染色。 1）直接染色 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、中性尼龙膜等）。 ① Western（转膜） 胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上。 膜 胶 蛋白 * * 一、抗药性筛选法 载体上携带有受体细胞敏感的抗生素抗性基因。 1. 原理： 利用载体上的携带的选择性标记基因筛选转化子或重组子 （1）四环素： （2）氨苄青霉素抗性基因： 产生?-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色。 抑制细菌生长，但不杀死细菌。 杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。 （3）环丝氨酸： 如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。 Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。 （1）四环素抗性插入失活 无环丝氨酸培养基 如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。 载体上携带有某些营养成分的生物合成基因，而受体细胞基因突变不能合成生命必须的营养物质。 三、显色筛选法 载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选 粒pUC18携带的lacZ’基因（蓝色反应） 利用有插入片段的重组载体分子量比野生型载体分子量大。 一、直接电泳检测法 从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。 重组克隆 载 体 1. 原理： 根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。 或用合适的内切酶切下插入片断，再用酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。