大肠杆菌感受态细胞几种制备方法.docVIP

大肠杆菌感受态细胞的几种制备方法 感受态细胞(Competent cells) ：常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。 转化：是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。 α-互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。当这种载体转入可编码?－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为α-互补现象。由互补产生的α-半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ(α)基因的失活，破坏α-互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。 方法一：TSS方法制备感受态细菌（又称一步法） 一、准备工作 1、缓冲液1×TSS的配制 事先配制1M的氯化镁：20.3g氯化镁(6分子水结晶)，定容于100ml去离子水后封装，不用灭菌。 取干净的100ml 量筒和100ml 烧杯，用量筒量取100ml去离子水，加入至烧杯中，取 1 g 蛋白胨，0.5g 酵母抽提物，0.5g 氯化钠，10 g PEG(MW= 3350)，5ml DMSO，5ml 的1 M氯化镁，溶解后用盐酸或者氢氧化钠调整pH为6.5，混匀后用0.22um 滤器过滤除菌。储存在4度，保质期约6个月。 2、已划平板（或者用枪头沾取并稀释后涂布）并在培养箱中过夜培养的菌种—Dh5α，用于接种并振荡培养。两个锥形瓶，分别装有30 ml和50ml LB，灭菌后置于4℃冰箱备用。 3、若干已灭菌的琼脂平板，一个未加抗生素，用于第二步的接种，其余做转化用。 二、感受态制备程序 前一天晚上调单菌落至30 ml LB中过夜培养（12-16h），按1：100 比例将过夜培养的菌液（500ul）加入到新鲜的50 ml LB培养液中，于37 ℃振荡培养至OD600约为0.4(培养时间2h40～50min)。冰浴30分钟后4度1000g离心10min，弃上清，收获细菌。加入原体积十分之一（这里为5 ml）的1× TSS 液(冰预冷)悬浮细胞，然后分装成100μl/份，全部冰上操作，-80℃保存。 三、转化 取一管（100μl）感受态细菌，（冻存细胞应置于冰上缓慢融化后立即使用）加入3-5μl DNA（0.1～100ng），轻轻混匀后冰浴30min。加入0.9ml含20mmol/L葡萄糖的LB培养液，37度150r/min温和振荡培养 60min，涂布，室温放置约20分钟后放于37度恒温培养箱过夜培养（17-20h）。 方法二：CaCl2法 细菌转化的方法多以Mendel和Higa（1970）的发现为基础，其基本方法是用冰预冷的CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化。 　　用CaCl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞，常用于成批制备感受态细菌。本法适用于大多数大肠杆菌菌株，且迅速、重复性好。 　　1．从37℃培养16～20h的新鲜平板中挑取一个单菌落（如大肠杆菌DH5α），或1ml新鲜的16～20h过夜培养物，转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养约2～3h（旋转摇床200～300r/min），每隔20～30min测量OD600值≈0.4。 　　2．在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置10～20min。 　　3．于4℃用SorvallGS2转头（或与其离心管相配的转头）以4000r/min离心10min，以回收细胞。 　　4．倒数培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。 　　5．以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀，放于冰上。 　　6．于4℃用SorvallGS3转头（或与其相应的