鲤鱼IECs+GLS和TOR基因cDNA克隆及其Gln对IECs蛋白合成影响和机理的研究.pdfVIP

鲤鱼IECs 的影响和机理研究 姜俊 (动物营养与饲料科学) 指导教师：周小秋教授 (四川农业大学动物营养研究所，四川雅安，625000) 摘要 本研究率先研究建立的鲤鱼(Cyprinus 模型，进一步利用该研究模型结合同位素示踪技术，分子克隆、生物信息学和荧光定量 布，探索了Gin对鲤鱼肠道不同肠段IECs蛋白质合成能力的影响及机理。结果如下： 1．研究建立了鲤鱼悬浮原代IECs研究模型。结果表明：分离鲤鱼IECs呈圆形，可 见明显两极特征，纯度95％，活力93％，分离IECs提取的DNA纯度更高，提取的总 RNA结构完整。结果表明：该模型可应用于PCR分子生物实验研究。 2．克隆了鲤鱼IECs 位到末端终止密码子1788位的开放阅读框，编码595个氨基酸残基的GLS蛋白前体， 分子量65．96kDa。核苷酸序列与斑马鱼的相似性为89．9％，与原鸡的相似性为69．4％， 表明：鲤鱼GLS氨基酸残基序列含有两个非常保守的区域，分别为17l~457位氨基酸 残基的GLS蛋白家族区域和484～570位氨基酸残基的锚定蛋白重复序列；氨基酸残基 位点和393、511位的酪氨酸残基磷酸化位点高度保守，是GLS蛋白功能调控位点；含 有10个高度保守的半胱氨酸残基，位于GLS蛋白家族区域和锚定蛋白重复序列，与 GLS蛋白分子结构稳定性和亚细胞定位密切相关。 3．克隆了鲤鱼IECs 15个氨基酸残基的TOR蛋白，分 位到末端终止密码子7548位的开放阅读框，编码25 鸭嘴兽、小鼠和大鼠相似性分别为74．5、78．4和78．5％，与人相似性为78．6％。蛋白质 15位氨 结构分析表明：鲤鱼TOR蛋白的1-348氨基酸残基为HEAT重复序列；349-25 位的FRB结构域(FKBPl2．RAP复合物结合区域)，2l19～2397位的激酶催化区域， 活性非常重要：N．端931～1039氨基酸残基序列含有内质网和高尔基体的定位序列，对 TOR蛋白定位于内质网和高尔基体膜非常重要： GDH、MDH和LDH活力均以鲤鱼中肠(2—5肠段)较高。 5．研究了鲤鱼不同肠段GLS活力大小和基因表达。结果表明：不同肠段GLS活力， 肠段GLS II 活力和mRNA表达量均较高。 6．研究了生长期不同体重鲤鱼不同肠段TOR基因表达量。结果表明：1肠段，18．19 组TORmRNA相对表达量显著低于其它各体重组(P，o．05)，18．1、3 1．19组之间以及 组TOR mRNA相对 组1肠段则显著高于2～5肠段和6～7肠段(尸o．05)。结果说明：随体重增加，鲤鱼肠 道TOR mRNA表达量增加，同时在幼龄阶段(309前)前中肠表达量高。 的影响。结果表明：蛋白质合成率2～3肠段显著高于其它各肠段(尸．o．05)，1肠段显著 Gin组(P0．05)， (尸o．05)；lmg／LGin组1-3肠段IECs蛋白质合成率显著高于0mg／L 高于后肠(5～7肠段)，Gin可提高前中肠(1~3肠段)IECs蛋白质合成能力。 Gln组(尸o．05)，高于 lmgrLGIn+DON和lmg／LGIn+RAP+DON组均显著低于lmg／L Gin Omg／LGin组(尸0．05)；lmg／LGIn+DON组显著高于lm