大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的克隆、表达、初步纯化及其免疫活性研究.pdf

中 文摘要 不耐热肠毒素(heat—labile enterotoxin，LT)，但是两者分别能引起典型的霍乱样腹泻， 及旅行者腹泻。同时它具有很强的潜在的免疫原性及粘膜免疫佐剂效应，以他们作为 佐剂能够显著刺激增强机体对抗原的免疫反应，但是其毒性限制了其的应用，随着LT 的i维结构的获悉，推动了人们对其B亚单位及其减毒突变体的研究，期望得到具有 很强的粘膜佐剂活性，同时其毒性具有相对较低甚至没有毒性的突变体。 coil 本实验的目的是为了研究大肠杆菌不耐热肠毒素(Escherlchia heat—labile 菌44815#菌株中提取其大质粒DNA，根据GENEBANK的序列设计引物调出l。TB的原始基 18-T 因，并将该基因通过PCR的手段进行扩增。进而将该基因克隆入pMDvector，通 过PCR及双酶切进行筛选鉴定，阳性克隆测序。将正确的基冈克隆到原核表达载体 LTB 达产物经SDS—PAGE分析，分子量为14KD，与理论值相符。凝胶灰度扫描显示pET2lb 表达量约占菌体总蛋白的16％。 将构建好的重组菌株进行扩大培养，离心收集细胞，经超声破碎后离心收集破碎 上清、通过阳离子交换柱(CM—FF)对目的蛋白进行初步纯化。以该纯化蛋白为佐剂， 将其分别与流感三价疫苗，儿型疱疹病毒(tlSV-II)gD糖蛋白混合后通过腹腔注射及 鼻饲法免疫BALB／cd、鼠，设单纯铝佐剂免疫为对照。免疫2，4，6周后尾静脉采血， ELISA法榆测其抗体水平，检测抗体水平升高后。将小鼠摘除眼球采血，全部处死后 平。通过与氢氧化铝佐剂对比表明其滴度显著高于氢氧化铝佐剂对照组。 结果表明：重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位具有粘膜免疫佐剂功效，该研 究结果为今后LTB的研究及应用奠定了基础。 关键词：大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位：表达；纯化；粘膜佐剂 ABSTRACT Themost mucosal todatearecholera powerful immunogensrecognized molecules toxin(CT)andEscherichiacoHheat—labileenterotoxin(LT)，the ofcholeraandtraveller7S thatcausethe secretions debilitatingwatery typical isSO thata anti—toxin induced diarrhoea，respectively．Theresponse potent immune iSalsoactivated molec— strong response againstforeignbystander ulesthatare atthemucosal presentsimultaneously theuseofLTasmucosal and inhumanshasbeen immunogensadjuvants