一种嗜热型碳酸酐酶基因的克隆表达及酶学性质.pdfVIP

第45卷第4期 工业微生物 V01．45No．4 翌!!兰!旦 !旦鱼望!堕坐丛堡竺垒!!!!盟 竺!：垫!! doi：10．3969／j．issn．1001—6678．2015．04．001 一种嗜热型碳酸酐酶基因的克隆表达及酶学性质 张朝晖，马晓舟 浙江工业大学生物与环境工程学院，杭州310014 conradii 摘要：本文将嗜热茵Methanocella HZ254的B型碳酸酐酶基因mtc在大肠杆茵中进行了 29kDa)产物条带。该表达产物具有催化CO：水合的活性，但没有酯酶活力。研究表明，重组酶在 40℃下稳定，40℃～60℃对酶有激活作用，65℃以上会导致酶的失活。在pH7．O时，酶有最好的 pH稳定性。1 用。1mmol／L的F一对酶活没有明显的影响，而磺胺和I一则有比较明显的抑制作用，Br一、HCO，一、 C1一、NO，一和S04“对酶均有一定的抑制作用。 conradii 关键词：MethanoceUa HZ254；嗜热型碳酸酐酶；克隆表达；酶学性质 碳酸酐酶(carbonicanhydrase，EC4．2．1．1)是艺，节省成本№J。本文研究的碳酸酐酶基因来自 Methanocellaconradii 一类能够高效催化二氧化碳与水生成碳酸氢根与氢 HZ254，该菌在中国水稻田发 离子的可逆反应的锌金属酶。它广泛存在于动植物 现¨3。，最适生长温度在50℃～55℃。 conradiiHZ254 及微生物中，且在很多的生物过程中起着重要的作 本文将把嗜热菌Methanocella 用，如CO：转移、光合作用、保持体内酸碱平衡和离 的B型碳酸酐酶基因mtc在大肠杆菌中进行克隆和 子运输等。目前，碳酸酐酶被应用于生物传感 表达，然后研究重组酶的酶学性质。 器‘1·21、天然活性物筛选‘3引、生物检测和CO：[61捕 1材料与方法 集等工艺。到目前为止，所发现的CA主要分为旺、 p、1三类。Ot类碳酸酐酶主要存在于动物中，B类1．1基因和菌种 conradii 主要存在于植物中，^y类主要存在于古细菌中。一 碳酸酐酶基因mtc，来自Methanocella 种来自Methanobacteriumthermoautotrophicum的B型HZ254全基因组DNA，由某高校实验室赠予。 耐热碳酸酐酶基因已被成功地在大肠杆菌中克隆和 1．2 目的基因PCR扩增的正反引物 CATATG 表达¨1。此外，还有一些耐热1型碳酸酐酶的报 F：GGAATrc 道，比如来自Methanosarcina GAGAAGAGCGT thermophila的MT- CA…01和来自Prrococcu,horikoshii的HPCA㈨等。R二CGC 本文研究耐热型碳酸酐酶的目的，是想把它们 1．3重组表达质粒的构建、转化及阳性克隆的检测 应用到一个新的CO：吸收工艺一整合真空碳酸盐 用限制性内切酶NdeI和BamH