两株新型抗人CD133单克隆抗体研制及其生物学特性的研究.pdf

两株新型抗人CDl33单克隆抗体的研制及其生物学特性的研究 中文摘要 摘 要 Prominin．1)以来，该分子已成为干细胞研究的热点。CDl33分子已成为分离、鉴 定包括造血系统和中枢神经系统等不同组织来源干细胞的新的表面标记之一。人 CDl33分子的转录由5个不同的启动子控制，导致至少有12个CDl33异构体剪 接形成，每个异构体以组织特异性方式表达，并受甲基化状态调控。CDl33基因 的不同剪接本产生不同的CDl33异构体已经逐步得以鉴定。CDl33在分子量和蛋 族中的一个新成员。同时CDl33的分子结构和蛋白表达提示它可能作为一种生长 因子受体而起作用，并参与细胞间信号传递。 CDl33 mRNA在成人多个系统组织中表达，CDl33蛋白表达在正常的造血干 祖细胞和胚胎神经上皮细胞，以及一些肿瘤细胞。体外实验显示，CDl33+肿瘤细 胞具有自我更新、增殖和多系分化等肿瘤干细胞(CSC)特征，越来越多的证据表 代表了独特的CSC群体，CDl33分子可能成为新的肿瘤治疗的靶点。但是CDl33 分子是否参与肿瘤干细胞的失控性增殖和自我更新尚待进一步研究。CDl33相对 应的配体分子及其细胞内与之相互作用的下游通路分子目前均不明确，而且对 CDl33分子的研究缺乏有效的实验手段。鉴此，研制抗人CDl33功能性单克隆抗 体将拓展对CDl33分子的研究，也为肿瘤干细胞研究和生物治疗提供新的途径。 本研究首先克隆了人CDl33基因，和构建了稳定表达CDl33的转基因细胞， 继而成功地研制了两株鼠抗人CDl33单克隆抗体，并对其生物学特性进行了初步 分析。在此基础上，探讨了CDl33分子在肿瘤细胞的表达及其对人单核细胞白血 病细胞株SHI．1的生物学效应。 两株新型抗人CDl33单克隆抗体的研制及其生物学特性的研究 中文摘要 一、人CDl33基因的克隆、基因转染细胞株的构建以及抗人CDl33单克隆抗体的 研制 【目的】克隆人CDl33编码区全长基因，构建能稳定表达人CDl33分子的基 因转染细胞株，进而以此为免疫原研制抗人CDl33单克隆抗体。 【方法】以ACl33．2抗原的基因序列为模板，通过重叠延伸PCR法克隆人 CDl33编码区全长基因，并进行测序验证：获得的CDl33编码区全长基因经Hind．皿 8抗 生素筛选获得稳定表达CDl33的基因转染细胞；流式细胞术分析报告基因GFP的 表达及CDl33分子在基因转染细胞膜上的表达。以表达人CDl33分子的基因转染细 mock分别流式筛选阳性、阴性杂交瘤克隆，经间接免疫荧光标记和流式细胞术分 析、反复筛选和多次克隆化培养，获得2个特异性分泌鼠抗人CDl33分子单克隆抗 体的杂交瘤细胞株；采用细胞核染色体计数、Ig亚型快速定性试纸法、竞争结合抑 制等实验，对获得的杂交瘤细胞株及单克隆抗体进行初步的生物学特性的鉴定。 【结果】(1)成功地克隆了人CDl33编码区全长基因，针对CDl33编码区全 长基因构建的重组质粒经双酶切后，能够释放出2600bp左右的目的基因片段，DNA 测序进一步证明插入载体中的基因片段与CDl33基因的序列完全一致；(2)获得 G418抗生素耐药的CDl33基因转染细胞，流式细胞仪检测表明，GFP报告基因在 达人CDl33蛋白；(3)成功获得2株持续和稳定分泌鼠抗人CDl33单克隆抗体的杂 交瘤细胞株，分别命名为14D7和10G1l。杂交瘤细胞核型分析显示，杂交瘤细胞 株的染色体数目在100条以上，超过小鼠B细胞和SP2／0细胞的染色体数，表明为融 合体；经过快速定性试纸分析显示，2株单抗轻链均为K链，14D7重链为IgG2a亚 类，而10G1l重链为IgG2b亚类；单抗识别的抗原表位分析结果表明，单抗lOGll II 两株新型抗人CDl33单克隆抗体的研制及其生物学特性的研究 中文摘要 位点不完全相同。 【结论】成功构建了稳定高表达人CDl33分子的基因转染细胞，为研制抗人 CDl33单克隆抗体提供了有效的免疫原。成功获得2株稳定分泌特异性鼠抗人 的不完全相同位点。