膜蛋白质组学及研究中样品制备净化方法发展应用.pdf

膜蛋白质组学及研究中样品制备净化方法发展应用.pdf

  1. 1、本文档共115页,可阅读全部内容。
  2. 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
  3. 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载
  4. 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
查看更多
优秀硕士毕业论文,完美PDF格式,可在线免费浏览全文和下载,支持复制编辑,可为大学生本专业本院系本科专科大专和研究生学士硕士相关类学生提供毕业论文范文范例指导,也可为要代写发表职称论文提供参考!!!

■■■●—●,■■■1 ll I——I li II TIIIlIIIIlIIIHIIIlII- II IIII ■誓■■—————■■■■■■■■—■———一Illlml FI—III—II II- liltr !ffIIIIII l llllII III Y191 2430 摘 要 膜蛋白质在许多生命活动过程中发挥着重要的作用,包括细胞与 环境之间的物质和能量交换以及信号转导等。然而,目前对于膜蛋白 的研究仍然面临很大的挑战,这主要是因为膜蛋白大多具有低丰度和 强疏水性的特点,从而给这些蛋白质的溶解、提取和酶解带来困难。 为了解决这些问题,通常会在膜片的水平上对膜蛋白质进行富集,并 且通过加入一些高浓度的添加剂 如去垢剂和有机溶剂等 来促进膜 蛋白质的抽提和溶解。SDS是最有效、最经典的去垢剂。但是,由于 SDS台g够降低蛋白酶的活力,影响酶解产物的色谱分离和抑制质谱分 析时的肽段的解离,所以,必须设法在酶解等后续实验步骤之前对样 品进行净化处理,以除去样品中的SDS及其他干扰物质。传统的样品 净化策略主要有沉淀法、透析、离子交换以及凝胶过滤等,尽管这些 方法都能在一定程度上除去样品中的小分子干扰物质,但它们都有一 个共同的缺陷,即在样品净化过程中往往导致明显的蛋白的损失,此 外,这些方法还在蛋白质鉴定效果和实验成本等方面存在一定的局限 性。在本研究中,我们针对现有方法的缺陷展开研究,发展了基于凝 胶电泳和预冷丙酮沉淀的样品制备和净化方法并将其应用于膜蛋白 质组学研究。 在基于凝胶电泳的方法研究中,我们采用了一种特殊设计的梯度 凝胶电泳 GGE 系统,包括一个琼脂糖上样层,若干个不同浓度的 聚丙烯酰胺凝胶分级分离层和一个高浓度 40% 的聚丙烯酰胺凝胶 封闭层。采用富集的大鼠肝脏膜蛋白作为样品的实验结果表明,通过 电泳驱动的方式,GGE系统能够去除样品和凝胶中85%以上的SDS。 此外,通过这种电泳驱动的方式不仅能够对含有高浓度SDS的蛋白 质样品进行有效的净化,而且能同时浓缩样品和对样品进行分级分离 而降低样品复杂程度,因而有利于后续的蛋白质酶解和LC.MS/MS 分析,大幅度提高蛋白质的鉴定效率。与文献报道的同类样品净化方 法管胶法和三明治凝胶电泳法相比,GGE策略鉴定的膜蛋白质总数 分别提高了213和222,尤其是那些具有极端性质 如分子量较高或 较低、丰度低或疏水性强 的蛋白质的鉴定效果得到明显的提高。 在基于预冷丙酮沉淀的样品制备和净化策略研究中,我们优化了 预冷丙酮沉淀法去除蛋白质样品中SDS及其他小分子干扰物质的实 验条件,比较了沉淀蛋白质复溶和溶液酶解的不同策略,建立起一种 基于溶液的蛋白质样品制备和净化的系统方法。该方法综合利用了 SDS对于生物膜的强裂解能力和有效溶解疏水性膜蛋白的能力、丙酮 沉淀法高效净化样品的能力以及NH4HC03溶液提供的适合胰蛋白酶 有效作用的适宜环境。实验结果表明,利用优化的预冷丙酮沉淀法能 使蛋白质样品中的SDS的含量降低至0.01%以下,并使蛋白质的回 收率保持在90%以上;预冷丙酮沉淀的蛋白质在NH4HC03溶液中能 被胰蛋白酶有效酶解。与文献报道的其他方法相比,此方法更有利于 蛋白质的酶解和鉴定,它所鉴定到的总蛋白和膜蛋白的数量分别平均 提高了26.6%和25.8%。此外,通过对所鉴定到的蛋白质的理化性质 进行的比较分析表明,这种优化的系统方法对于各种类型的蛋白质包 Ⅱ 括高疏水性和多跨膜的蛋白质的鉴定具有普适性,在蛋白质化学和蛋 白质组学研究领域具有重要的应用价值。 关键词:十二烷基硫酸钠 SDS ,蛋白质分级分离,梯度凝胶电泳, 丙酮沉淀,溶液酶解,胶内酶解,质谱,膜蛋白质组 Ⅲ Abstract Membrane rolein molecular many processes, proteinsplayimportant thematerialand betweenthecellandits including energyexchange environment,cell—cellinteractions,and signal theresearchonthemembranestillfacesa at proteins greatchanllenge duetothefactthatmostofmembrane areoflow present proteins abundanceand makestheir solubilization, highhydrophobicity,which extractionand difficult.Toaddressthese enzymolysis pro

文档评论(0)

wpxuang12 + 关注
实名认证
内容提供者

该用户很懒,什么也没介绍

1亿VIP精品文档

相关文档