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■誓■■—————■■■■■■■■—■———一Illlml FI—III—II II- liltr !ffIIIIII l llllII III Y191 2430 摘 要 膜蛋白质在许多生命活动过程中发挥着重要的作用,包括细胞与 环境之间的物质和能量交换以及信号转导等。然而,目前对于膜蛋白 的研究仍然面临很大的挑战,这主要是因为膜蛋白大多具有低丰度和 强疏水性的特点,从而给这些蛋白质的溶解、提取和酶解带来困难。 为了解决这些问题,通常会在膜片的水平上对膜蛋白质进行富集,并 且通过加入一些高浓度的添加剂 如去垢剂和有机溶剂等 来促进膜 蛋白质的抽提和溶解。SDS是最有效、最经典的去垢剂。但是,由于 SDS台g够降低蛋白酶的活力,影响酶解产物的色谱分离和抑制质谱分 析时的肽段的解离,所以,必须设法在酶解等后续实验步骤之前对样 品进行净化处理,以除去样品中的SDS及其他干扰物质。传统的样品 净化策略主要有沉淀法、透析、离子交换以及凝胶过滤等,尽管这些 方法都能在一定程度上除去样品中的小分子干扰物质,但它们都有一 个共同的缺陷,即在样品净化过程中往往导致明显的蛋白的损失,此 外,这些方法还在蛋白质鉴定效果和实验成本等方面存在一定的局限 性。在本研究中,我们针对现有方法的缺陷展开研究,发展了基于凝 胶电泳和预冷丙酮沉淀的样品制备和净化方法并将其应用于膜蛋白 质组学研究。 在基于凝胶电泳的方法研究中,我们采用了一种特殊设计的梯度 凝胶电泳 GGE 系统,包括一个琼脂糖上样层,若干个不同浓度的 聚丙烯酰胺凝胶分级分离层和一个高浓度 40% 的聚丙烯酰胺凝胶
封闭层。采用富集的大鼠肝脏膜蛋白作为样品的实验结果表明,通过 电泳驱动的方式,GGE系统能够去除样品和凝胶中85%以上的SDS。
此外,通过这种电泳驱动的方式不仅能够对含有高浓度SDS的蛋白
质样品进行有效的净化,而且能同时浓缩样品和对样品进行分级分离
而降低样品复杂程度,因而有利于后续的蛋白质酶解和LC.MS/MS
分析,大幅度提高蛋白质的鉴定效率。与文献报道的同类样品净化方
法管胶法和三明治凝胶电泳法相比,GGE策略鉴定的膜蛋白质总数
分别提高了213和222,尤其是那些具有极端性质 如分子量较高或
较低、丰度低或疏水性强 的蛋白质的鉴定效果得到明显的提高。 在基于预冷丙酮沉淀的样品制备和净化策略研究中,我们优化了
预冷丙酮沉淀法去除蛋白质样品中SDS及其他小分子干扰物质的实
验条件,比较了沉淀蛋白质复溶和溶液酶解的不同策略,建立起一种
基于溶液的蛋白质样品制备和净化的系统方法。该方法综合利用了
SDS对于生物膜的强裂解能力和有效溶解疏水性膜蛋白的能力、丙酮
沉淀法高效净化样品的能力以及NH4HC03溶液提供的适合胰蛋白酶
有效作用的适宜环境。实验结果表明,利用优化的预冷丙酮沉淀法能
使蛋白质样品中的SDS的含量降低至0.01%以下,并使蛋白质的回
收率保持在90%以上;预冷丙酮沉淀的蛋白质在NH4HC03溶液中能
被胰蛋白酶有效酶解。与文献报道的其他方法相比,此方法更有利于
蛋白质的酶解和鉴定,它所鉴定到的总蛋白和膜蛋白的数量分别平均
提高了26.6%和25.8%。此外,通过对所鉴定到的蛋白质的理化性质
进行的比较分析表明,这种优化的系统方法对于各种类型的蛋白质包 Ⅱ
括高疏水性和多跨膜的蛋白质的鉴定具有普适性,在蛋白质化学和蛋 白质组学研究领域具有重要的应用价值。
关键词:十二烷基硫酸钠 SDS ,蛋白质分级分离,梯度凝胶电泳,
丙酮沉淀,溶液酶解,胶内酶解,质谱,膜蛋白质组 Ⅲ Abstract Membrane rolein molecular many processes, proteinsplayimportant thematerialand betweenthecellandits
including energyexchange
environment,cell—cellinteractions,and signal
theresearchonthemembranestillfacesa at proteins greatchanllenge duetothefactthatmostofmembrane areoflow
present proteins
abundanceand makestheir solubilization, highhydrophobicity,which
extractionand difficult.Toaddressthese enzymolysis pro
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