暹罗鳄(Crocodylus+siamensis)抗菌活性物质筛选的抗菌肽hepcidin基因克隆表达.pdf

暹罗鳄(Crocody／us i di 选及抗菌肽hepcn基因的克隆表达 专业：水生生物学 姓名： 郝娟 导师：谢明权教授 摘要 鳄鱼是一类古老的爬行动物，在物种进化中占据重要的地位，其抗菌肽等免 疫相关因子的研究相对较少。本论文在认真分析国内外有关报道的基础上，以人 工养殖的暹罗鳄为对象，以探寻新的抗菌肽为目标，应用蛋白质分离纯化技术、 基因克隆及体外表达技术、结合生物信息学软件分析，主要取得了以下研究结果： (1)全面研究了暹罗鳄不同组织粗提物的抗菌活性，发现血液、肝脏和卵 巢提取物对金黄色葡萄球菌的抗菌活性最强。暹罗鳄的新鲜血清可以抑制革兰 氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长，560C灭活30min后活性降低或丧失。用乙 酸提取法制备的暹罗鳄白细胞粗提物对金黄色葡萄球菌和尖孢镰刀菌具有明显 的抗菌活性。扫描电镜结果显示，粗提物处理30rain后，会黄色葡萄球菌菌体 表面变得粗糙，有明显的颗粒状附着物，细胞壁有内陷：处理60mm后，细胞 严重萎缩、变形，附有大量胶块状物质。处理后的尖孢镰刀菌孢子形态由表面 光滑的镰刀状变成了表面附有大量乳突状物质的球形。 (2)通过蛋白质层析技术结合非变性酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳(AU．PAGE) 纯化了白细胞粗提物中的一种抗菌活性物质，经过Shotgun串联质谱分析，推测 该活性物质是组蛋白H1样的蛋白或肽段，并将其命名为Cshistidin。 cDNA，其ORF编码一个99．aa的前肽原 (3)克隆了暹罗鳄hepcidin Cs．hepc的分子量为2933．46Da，理论等电点为8．53，构建的Cs．hepc三维结构 呈现一个典型的13-sheet构象。分别从DNA水平和蛋白质水平上对暹罗鳄 相对于两栖类和鱼类，暹罗鳄preprohepcidin与哺乳类的亲缘关系更近。 (4)运用Real．time PCR研究了暹罗鳄hepcidin在健康鳄鱼中的组织表达， 结果表明：暹罗鳄hepcidin在肝脏、肌肉、心脏、肾脏、小肠、血液、脂肪、脾 脏、性腺和肺中均有表达。其中肝脏表达量最高，其次是肌肉和心脏，肝脏表达 量是肌肉表达量的八十多倍，是心脏表达量的三百多倍。肾脏中的表达量最低。 coli 表达系统中成功的诱导表达了融合蛋白Trx．hepc。用肠激酶酶切后，获得了与预 期大小一致的目的产物，但是没有检测到明显的抗菌活性。 (6)合成了完全为酵母偏爱密码子的编码暹罗鳄hepcidin的基因 导的方法在毕赤酵母KM71中实现了目的产物的高效表达。活性分析表明：三 种表达上清对四株细菌均有明显的抑菌效果，其中Cshepc的活性最强， subtilis)的抑菌活性最强，50 长，对水产病原菌温和气单胞菌(Aeromonassobria)的活性较弱。用镍柱亲和 层析法从表达上清中纯化了带有组氨酸标签的融合蛋白Cshepc／6His，为暹罗鳄 hepcidin的高效制备奠定了良好的基础。 关键词：暹罗鳄，抗菌物质，hepcidin，克隆表达 ●●● ·■ o ■ ● - · 一 ll 一 0I blal antlmicroactivesnbstancesand SCreenlng and of from expressionhepcidinCrocodylus cloning SZ口mensls Major：Hydrobiology Name：HaoJuan