栉孔扇贝Chlamys farreri酚氧化酶的分离纯化及其特性的研究.pdf

栉孔扇贝(Chlamys力脚“)酚氧化酶的分离纯化及特性研究 摘要 前期研究发现，细菌多糖刺激和病毒感染均可导致栉孔扇贝(Chlamys farreri)血细胞中酚氧化酶活力急剧升高，表明酚氧化酶是栉孔扇贝免疫应答系 et et 统中最为敏感高效的因子之一(Xinga1．，2008；Lina1．，2011)。本论文从栉i 孔扇贝血细胞中分离纯化出酚氧化酶，分析了该酶的生化及酶学特性；研究了酚 氧化酶体外氧化产物的抗菌活性；分析比较了栉孔扇贝酚氧化酶与海湾扇贝 (Argopectenirradians)、菲律宾蛤仔(Ruditapes (Haliotisdiscus hannai)、毛蚶(Scapharca 特性上的差异，为栉孔扇贝酚氧化酶免疫机制的研究积累了数据。 (1)栉孔扇贝酚氧化酶的分离纯化及生化和酶学特性研究。采用线性连续 分离纯化出酚氧化酶，研究了该酶的底物特异性、动力学参数以及温度、pH、 二价金属离子和抑制剂对酶活的影响。结果显示：提纯的酚氧化酶在native．PAGE 成的寡聚体；酚氧化酶对L．DOPA、邻苯二酚、多巴胺和对苯二酚的米氏常数 种漆酶型的酚氧化酶，其对邻苯二酚的亲和力最高，对多巴胺的亲和力最低，对 8．0时具有最高酶活力； L．DOPA的亲和力高于对苯二酚；酚氧化酶在30C和pH 活力不受硫代尿素和叠氮钠的影响，但受到抗坏血酸、亚硫酸钠、柠檬酸、半胱 抑制，表明该酶是一种含铜的金属酶。 (2)栉子L扇贝酚氧化酶体外氧化产物的抗菌活性研究。通过观察和测定提 纯的栉孔扇贝酚氧化酶与底物处理后的细菌生长情况，研究了栉孔扇贝酚氧化酶 体外氧化产物对溶藻胶弧菌Vibrio parahaemolyticus、杀鲑气单胞菌Aeromonas tarda、停乳链球菌Streptococcus iniae 和溶壁微球菌Micrococcus T 栉孔扇贝(Chlamysfarreri)酚氧化酶的分离纯化及特性研究 示：酚氧化酶自身不能抑制细菌生长，酚氧化酶与L．DOPA或多巴胺的混合物可 抑制细菌生长，表明是酚氧化酶的氧化产物而不是酚氧化酶具有抗菌活性；使用 L-DOPA作底物时，酚氧化酶氧化产物仅对杀鲑气单胞菌显示出明显的抑制作 用，而使用多巴胺作为底物时，酚氧化酶氧化产物对革兰氏阴性的溶藻胶弧菌、 副溶血弧菌和杀鲑气单胞菌均表现出强烈的抑制作用，表明以多巴胺为底物获得 的酚氧化酶氧化产物比以L．DOPA为底物获得的氧化产物具有更强的细胞毒性； 酚氧化酶的体外氧化产物对革兰氏阳性的停乳链球菌、海豚链球菌和溶壁微球菌 无抑制作用，表明与链球菌和微球菌相比，栉孔扇贝酚氧化酶氧化产物对弧菌和 气单胞菌细胞成分的毒性作用更大；酚氧化酶氧化产物对同为革兰氏阴性的爱德 华氏菌无抑制作用，分析原因可能是爱德华氏菌分泌的胞外产物中含有一些具有 抗氧化活力的多糖，这些多糖抑制了酚氧化酶的氧化反应。显微镜检测结果显示： 经过与栉孔扇贝酚氧化酶和多巴胺的共孵育后，溶藻胶弧菌、副溶血弧菌和杀鲑 气单胞菌的菌体透明度降低，多数菌体丧失了运动能力，细菌聚集成团，被黑色 素所覆盖。 (3)栉孑L扇贝酚氧化酶与海湾扇贝、菲律宾蛤仔、皱纹盘鲍、毛蚶酚氧化酶 的生化及酶学特性比较研究。采用线性连续梯度非变性电泳结合邻苯二酚发色方 法从海湾扇贝、菲律宾蛤仔、皱纹盘鲍、毛蚶的血细胞中分离出酚氧化酶，分析 比较了栉孔扇贝酚氧化酶与海湾扇贝、菲律宾蛤仔、皱纹盘鲍、毛蚶酚氧化酶在 底物特异性、动力学参数以及金属离子和抑制剂对酶活的影响上的差异。结果显 示：在检测到的酚氧化酶种类上，栉孔扇贝与海湾扇贝、菲律宾蛤仔、皱纹盘鲍 相同，在血细胞中仅检测到一种酚氧化酶，而从毛蚶的血细胞中则检测出4种酚 S174P0和SuPO)中的酚氧化酶差异较大；在底物特异性上，栉孔扇贝酚氧化 酶与海湾扇贝、菲律宾蛤仔、皱纹盘鲍和毛蚶中的酚氧化酶相似，均可以氧化邻 二酚类底物和对二酚类底物，为漆酶型的酚氧化酶；在动力学参数上，栉孔扇贝