第四章 目的基因的制取.ppt

抗体鉴别阳性克隆 用专门设计的表达载体，将真核基因编码的蛋白质在大肠杆菌中实现表达，通过免疫化学法进行检测。 差示杂交 需要两种不同的细胞群体（目的基因正常表达、目的基因不表达），分别制备两种不同mRNA提取物，以两种总mRNA探针（或以相应的cDNA作探针)平行杂交，对有表达目的基因的细胞总mRNA构建的克隆文库进行筛选。 差别杂交的局限性： 1.杂交灵敏度低，对于低峰度的mRNA尤为明显。 2.工作量大，重复性差，两套平行滤膜之间的DNA保有量有差别，导致杂交信号不一致。 DNA的化学合成 寡核苷酸单链的化学合成 探针的化学合成 连接子和接头的合成 基因的半合成 全长基因化学合成 三 化学法合成目的基因 DNA的化学合成法有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酰胺法、氢磷酸法、寡核苷酸连接法等，现在常用的是固相亚磷酰胺法，使用全自动合成仪，将一个不同的单核苷酸按照需要连接起来再经脱保护处理、纯化，获得一个特定的DNA片段。 这种方法主要适用于已知核苷酸序列的、分子量较小的目的基因的制备。 方 法 磷酸二酯法 亚磷酸三酯法 寡核苷酸连接法 磷酸二酯法 磷酸二酯法的基本原理：将二个分别在5′-或3′-末端带有保护基的脱氧单核苷酸连接起来，形成一个带有磷酸二酯键的脱氧二核苷酸。 具5′保护的单核苷酸，便能够通过它的3′-OH 同另一个具有3′保护的单核苷酸的5′-P之间