体外构建用于治疗显性脊柱裂组织工程复合支架实验及研究.pdf

·中文论著摘要· 体外构建用于治疗显性脊柱裂的组织工程 复合支架的实验研究 ．屿!-垒 和置 先天性脊柱裂在人群中的发病率为19／oo．59／00，中国的发病率要明显的高于西方 国家。根据目前的研究结果表明，先天性脊柱裂多为遗传病，受环境因素和遗传 因素共同影响。随着产前诊断的发展，越来越多的脊柱裂可以在胎儿期被诊断出 来，早期发现和治疗有利于脊柱裂治疗效果的提高。现有在胎儿阶段对脊柱裂的 治疗只有胎儿外科，但是由于手术条件等诸多限制导致治疗效果不尽如人意。有 许多孕妇由于缺少有效的治疗方法，被迫选择中止妊娠。为了使更多家庭免受这 样的痛苦，我们寻求更好的治疗脊柱裂的方法。组织工程技术的日益发展为我们 提供了新的思路，目前有许多疾病可以结合组织工程得到很好的治疗，例如皮肤 烧伤，骨缺损，神经损伤等等。脊柱裂可沿脊柱的任何部位发生，由于保护脊髓 的脊柱骨闭合不全，导致脊髓和神经的损伤，显性脊柱裂还伴有病变部位的皮肤 缺损。因此利用组织工程技术，制作双层支架，分别来修复病变部位的皮肤缺损 以及神经损伤有广阔的应用前景。 本文利用骨髓间充质干细胞作为种子细胞分别种植在纤维蛋白胶支架、壳聚 糖．明胶支架上，寻找合适的种子细胞浓度，培养条件并探寻BMSCs在壳聚糖．明 胶支架上向神经方向分化的可能性，最后在体外用纤维蛋白胶、壳聚糖．明胶支架 构建用于治疗先天显性脊柱裂的复合支架，为体内移植打下基础。 实验材料与方法 1、实验材料试剂与主要仪器 实验主要材料包括壳聚糖．明胶支架(天津中医药大学提供)，人血纤维蛋白 1 (德国Leica) 2、实验方法 选取四周龄体重在1009左右的SD大鼠，分离提取原代的骨髓问充质干细胞， 待传代传至P3以上，冻存备用。选取孔隙率较高，孔径均匀的壳聚糖．明胶材料， 将BMSCs以合适的浓度接种其上，联合培养2天左右，待细胞在支架上状态稳定 后，加入20ng／ml的BDNF使其向神经方向分化。探索合适的纤维蛋白原以及凝 血酶浓度，接种的种子细胞浓度，为下一步的体内移植打下基础。 实验结果 1、骨髓问充质干细胞(BMSCs)的分离培养 分离出骨髓间充质干细胞，原代培养24h，大部分细胞贴壁生长，2天后第一 次换液，可以观察到细胞成簇生长。5天左右可以观察到细胞集落差不多融合长 满瓶底，可以传代，其后大概每两天传代一次，P3以后的BMSCs纯度可达90％ 以上。 2、壳聚糖．明胶支架、纤维蛋白胶支架的表征 观察到壳聚糖．明胶支架内部孔径均匀一致，互相连通，孔径多在300。400I．tm 左右，孔隙率在90％以上，可为BMSCs提供一个很好的良好的生存空间。纤维 蛋白胶表面由较为致密的纤维搭建而成，内部为一些不规则的多孔。随着纤维蛋 白原浓度的增加，纤维蛋白胶支架的机械强度变大，内部的纤维蛋白网络也更加 致密，适合BMSCs生长的最佳条件为凝血酶浓度为50KIU／ml，纤维蛋白原浓度 为30mg／ml。 3、骨髓间充质干细胞在两种支架中的存活、增殖和生长 3．1、BMSCs在壳聚糖。明胶支架上的生长情况 经过两周的培养观察，在培养一周时间后对支架进行FDA活细胞染色，发现 支架内部和表面均有大量的活细胞生长，且生长状态良好。两周后取材做电镜及 2 HE染色，电镜观察发现支架内部有正处于分裂期的细胞，分泌大量细胞外基质， 并伸出伪足，生长状态良好，HE染色发现支架内部细胞彼此连接形成网络，攀附 于孔壁上。 使用正常含10％FBS的DMEM．F12的培养基培养壳聚糖．明胶支架复合物两 天，再使用含浓度为20ng／mlBDNF的培养基培养一周。对支架进行固定取材，切 片，进行nestin染色。在支架上发现nestin阳性细胞，HE染色和电镜下观察到神 经干样细胞，神经元样细胞，证明支架BMSCs在支架上可以向神经方向分化。 3．2、BMSCs在纤维蛋白胶支架上的生长情况 选取