三唑磷酶联免疫分析方法及其试剂盒研究.pdf

中文摘要 硫代磷酸胺(THHe)基础之上，分别与BSA偶联获得免疫原，结合比分别为166：1和8．2：1， 经免疫兔子得到两种抗三唑磷多克隆抗体(抗THBu抗体、抗TnHe抗体)，相应冻干粉的 56×10’。 效价分别为512×105和2 通过比较不同的ELISA方法，选用了包被抗体直接竞争ELISA分析方法，包被抗THBu 抗体与三唑磷或酶标半抗原HRP．THHe竞争反应。对固相载体、包被缓冲液、盐离子浓度、 甲醇浓度、包被温度、时间、减少非特异性吸附的方法等因素的筛选试验比较，优化了酶 4O．01M 联免疫分析的方法和条件。优化后结果显示：用美国CoStar板，pH7PBS稀释包被 抗体，在37。C下包被2h效果最佳；反应介质加入2％牛奶可减少非特异性吸附，提高检测 灵敏度；盐离子浓度o02M，甲醇含量5％有利于抗原抗体竞争反应。利用优化后的分析条 件，用直接竞争ELISA方法进行了抗体亲和性和特异性研究。结果表明，抗THBu抗体对 三唑磷有较高的亲和性，三唑磷与抗体在1．95-1000ng／mL浓度范围内，抑制率与浓度呈线 性关系，线性回归方程为y=12622Ln(x卜2092，RZ=0．993，抑制中浓度Ic50=62．0ng／mL， 最低检测限IC20=576ng／mL。抗THBu抗体对三唑磷有很高的特异性，对各类似物如二嗪 磷、毒死蜱等的交叉反应率2．4×104。 用抗THBu抗体初步研制了三唑磷残留检测用直接竞争ELISA试剂盒，对样品基质影 响、试剂盒保存期、试剂盒检测数据评价进行了初步试验，可用于水、稻米、黄豆(干)、 胡萝h、土豆、大白菜、洋葱、茄子、梨、柑桔等样品的检测。试剂盒准确度较好，除梨样 48～132．27％；试剂盒的重现性好，除胡萝b样品 品添加回收率在50％左右，其余样品在6l 外，其他板间变异系数均小于12．93％，可满足样品中三唑磷残留量的检测。本研究为开发 具有自主知识产权的国产化试剂盒奠定了基础。 关键词：三唑磷，酶联免疫吸附分析，试剂盒，农药残留 Ⅲ ABSTRACT Two ofinsecticide haptens triazophos[O，O-diethyl and phosphoramidothioate] THHe[O—ethyl， werethen Carboxyamyl)phosphoramidothioate]，weresynthesized．Thesehaptens covalently ontobovineselmn theCDI servedas methodand coupled albumin(BSA)with immunogens ratios andBSA (THBu—BSAandTHHe-BSA)The ofhaptens and obtained spectrometer．Twoantibodies，i．e．，anti—THBu-Abanti·THI-Ie-Ab，were by therabbitswithTHBu-BSAandTHHe-BSA titersweremeasured immunizing