胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒载体的构建鉴定.pdf

胶质细胞源性神经营养因子重组腺病毒载体 的构建及鉴定 摘 要 cell lme．derived neurotrophic 腺病毒载体，为后续的缺血性脑损伤基因治疗的研究做准备。方法：1．从 美国国家医学图书馆互联网核酸数据库检索到GDNFcDNA序列，设计 提取总RNA，紫外分光光度法测定和甲醛琼脂糖凝胶电泳鉴定后，以提取 GDNFcDNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定及测序鉴定后，纯化回收，限制性内 切酶Hind Ill、Kpn 酶切产物纯化后，在T4 于pAdTrack-CMV的HindI酶切位点之间，纯化回收连接产物。 llI、Kpn 3．用氯化钙制备感受态大肠杆菌DH5a，将连接产物转入感受态大肠杆菌 DH5 Q后，接种在含有卡那霉素的阳性培养基中大量扩增。取一部分扩增 的大肠杆菌DH5d提取质粒，以提取的质粒为模板，GDNF的特异性上、 下游引物做PCR鉴定，并将质粒DNA做限制性内切酶HindI双 III、Kpn 酶切鉴定；另一部分扩增的大肠杆菌送交测序中心做测序分析。结果：1．提 RNA及28s 取的新生大鼠纹状体总RNA经甲醛琼脂糖凝胶电泳可见18s RNA的清晰条带，且28s RNA条带的亮度是18sRNA的两倍；紫外分光 受态大肠杆菌DH5Ⅱ后，限制性内切酶Hind I双酶切 III、Kpn DNA连接酶连接酶切产物，将连接产 pAdTraek．CMV及，GDNFcDNA，T4 物转入大肠杆菌DH5Q，接种到含有卡那霉素的固体培养基中培养，生长 良好，见大量菌斑。4．将于卡那霉素阳性培养基中培养的大肠杆菌DH5 Q提取质粒，以提取的质粒为模板，GDNF的特异性上、下游引物做PCR I酶切提取的质粒后，琼脂糖凝胶电泳得约650bp的片段和9200bp的片段。 功。 关键词：胶质细胞源性神经营养因子；大鼠；基因重组；载体 CONSTRUCTIONANDIDENTmCATIoNOFTHE RECOMBINANTADENOVIRALVECToRCARRYINGRAT GLIALCELLUNE-DERIvEDNEURoTRoPmCFACToRGENE constructthe adenoviralvector recombinant Abstact：0bjective：To by of recombinationforthe Of cerebral gene technologypreparationgenetherapy eDNA oftherat cellline—derived ischemia，obtainfragment glial neurotrophic clone into RT-PCR，thenGDNFcDNA factor(GDNF)by pAdTrack-CMV． Methods：1．TheeDNA ofGDNFwasretrievedfromAmer