抗HIV-2gp36基因工程抗原单克隆抗体的制备、鉴定和初步应用.pdfVIP

中文摘要 抗HIV_2 gp36基因工程抗原单克隆抗体的制备、鉴 定和初步应用 摘 要 致的艾滋病，是当今严重威胁人类生命健康的重大疾病，传 播广泛迅速，病死率极高，至今尚无治愈方法；检测病毒抗 原早期发现感染者，益于对之早期治疗和严格监控，是遏制 艾滋病发病和传播的有效手段。我国早期传入和流行的艾滋 病毒是HIV-1，针对其代表性病毒抗原p24制备单克隆抗体 (简称单抗)的研究已有报道；而近年发现我国也有HIV-2 感染和传播，但尚无针对其代表性病毒抗原gp36制备单抗 的报道。本研究的目的是，制备稳定产抗gp36基因工程抗 原单克隆抗体的杂交瘤细胞株及相应单抗，鉴定细胞株的生 物学特性和单抗的免疫学特性及理化特性；初步探索用所制 EUSA法的适用性；为早期发现HIV-2 单抗构建检测gp36 病毒感染者，提供可资应用的单抗和技术支撑。 方法：用基因重组gp36抗原免疫B劁LB／c小鼠5次， 第一次与第二次免疫间隔4周，其后每次免疫间隔2周， 融合前三天gp36抗原尾静脉注射进行攻击。取免疫脾细胞 与骨髓瘤细胞株Sp2／0，用50％聚乙二醇(PEG)融合，地虹 培养基选择培养出融合细胞。用gp36作为抗原包板，间接 ELISA法，初筛分泌抗gp36抗体的融合细胞，有限稀释法 克隆化培养获得稳定分泌抗gp36单抗的阳性杂交瘤细胞 株。以体外连续传30代、液氮中冻存3个月后复苏，测定 中文摘要 细胞株分泌单抗的稳定性。杂交瘤细胞株细胞注入BALB／c 小鼠腹腔，每只注射1×106个细胞，制备腹水，得腹水型单 抗；杂交瘤细胞株细胞置于完全培养液内培养，细胞长满后 取上清，得上清型单抗；杂交瘤细胞株细胞用无血清1640 液培养，待细胞充分生长后收集上清，得无血清型单抗，作 型单抗的效价，同样的方法测定其与gp36反应的特异性及 与HIV．1 和8H9)做耐热性、耐冻融性实验及pH值对单抗稳定性影 保存7d。耐冻融性实验是腹水型单抗于．20℃冻存后室温自 然融化，反复冻融6次后测定效价。测定pH值对单抗稳定 性影响实验，是分别以O．05M pH2．2甘氨酸．盐酸缓冲液， O．01M pH7．4磷酸盐缓冲液(PBS)和O．05MpH9．6碳酸盐 缓冲液将腹水型单抗(以正常鼠血清作阴性对照)作1：100 与阴性对照OD450的比值。采用饱和硫酸铵(SAS)沉淀法 效价并比较其相对亲和力。用HRP标记SAS．McAb，并用 直接ELISA法测定标记后的单抗效价。用阴离子交换介质 DEAE．Sepharose 中文摘要 曲线，找出OD．50对应的抗体浓度，计算亲和力。以gp36 免疫新西兰白兔制备抗gp36的血清型多克隆抗体(多抗)。 以SAS沉淀法纯化血清型多抗中的IgG类抗体。用纯化的 抗gp36的单抗与单抗、单抗与多抗分别进行配对，建立单 抗．酶标单抗夹心EUSA法和单抗．酶标多抗夹心EUSA法： 检测不同稀释浓度的gp36，确定检测的敏感性；检测与 HIV-1 p24、gp41和gpl20的交叉反应性，确定检测的特异 性。 结果： 经细胞融合、地虹选择培养、抗体检测筛选、克隆化 培养得到九株稳定分泌抗gp36单抗的杂交瘤细胞株，分别 细胞株稳定性较好，体外连续传30代、液氮中冻存3个月 后复苏测定，细胞株仍可稳定分泌单抗。 腹水型单抗中，．8E5、12E3、8直9和5E9的效价较高，前 的Ig类别为IgG2b外，其余均为IgGl。抗体特异性检测发 合，不与HIV-1 与gpl20发生交叉反应，5G6、7氏‘与gp41发生交叉反应。 取杂交瘤细胞株8E5和8H9腹水，鉴定单抗的热稳定性 和耐冻融性及不同pH条件对单抗稳定性的影响。结果发现： ①8E5腹水，4℃放置7d，效价未降低；37℃放置7d后效价 中文摘要 果显示，酸性和碱性都可使单抗稳定性下降，酸性条件影响 尤为严重。 单抗建立单抗．酶标单抗夹心EUSA法，对基因重组