小麦近缘种谷蛋白新亚基鉴定和编码基因克隆及分子进化分析.pdf

首都师范大学博士论文 摘 要 小麦谷蛋白是贮藏蛋白中的主要成分，由高分子量谷蛋白亚基(HMw．GS)和低分子 小麦面粉的加工和烘烤品质。研究显示，粗山羊草(Aegilops 的Glu，JDf位点编码的HMW-GS变异类型丰富，且大多为普通小麦中尚未发现的新类型。 栽培一粒小麦(Triticummonococcum 等位基因出现的变异频率也非常高，因此从小麦近缘种中寻找新的候选优质谷蛋白基因对 小麦品质改良具有重要意义。本研究以粗山羊草和栽培一粒小麦为材料，利用十二烷基硫 行分离和鉴定，然后设计等位基因特异PCR(AS．PCR)引物对其编码基因进行分子克隆、 序列测定与结构比较，分析贮藏蛋白基因家族的分子进化关系和预测谷蛋白的二级结构特 coil 征，并将来自粗山羊草和硬粒小麦的HMW-GS编码基因连接到表达载体上，使其在E 中高效表达，初步探讨其表达特性。主要研究结果如下： 1．粗山羊草嗍谷蛋白新亚基的分离与鉴定 包括2．4个蛋白点。同时，在HPCE图谱中，这些亚基多表现为一个主峰加1．2个副峰， Da、86934．5 测得的1Dxl．6‘、1Dx3‘和1Dx5．2‘亚基的精确分子量分别为88565．8Da和 Da。 86651．2 2．粗山羊草HM．GS编码基因的分子克隆、序列比较和进化分析 首都师范大学博士论文 基。推导的氨基酸序列具有典型的HMW-GS的序列结构特征，由21个氨基酸的信号肽、 氨基酸序列推导的成熟蛋白的分子量，均比质谱测得的种子中亚基的精确分子量小，其差 基化或磷酸化等。另外，三个亚基基因序列中存在着丰富的单核苷酸多态性(SNPs)，共 检测到29个SNPs，其中有义突变为63％，多数为谷氨酰胺，1事氨酸一精氨酸突变。进化分 析表明：来自粗山羊草的x-型亚基与普通小麦中的1Dx亚基同源性很高，基因和氨基酸序 列的相似性达到97％．99％。 3．克隆基因的原核表达 设计两对不含有信号肽的表达引物，分别扩增硬粒小麦Simcto中的y-型亚基基因1By8 测显示，Ecoli中表达的蛋白和种子蛋白均与HMW-GS多克隆抗体出现较强的杂交信号。 这些体外表达的蛋白纯化后，可进行亚基功能的进一步鉴定。 4．栽培一粒小麦LMW-GS编码基因的鉴定、分子克隆与进化分析 H 首都||ili范大学博士论文 DNA序列，包括上游、开放阅读框和下游，均无内含子。根据推导出的氨基酸序列，三个 因有较高的相似性，但同时也具有独特的特征。尤其在LMW-M5基因的C．端，除了含有8 个保守的半胱氨酸残基之外，还发现一个额外半胱氨酸残基。这是首次报道的含有九个半 胱氨酸残基的LMW-i型亚基，半胱氨酸残基的增加会提高谷蛋白的粘弹性，因此LMW-M5 可能为优质亚基。LMW-GS二级结构预测显示：N-端保守区和中央重复区的氨基酸大部分 或全部形成B转角或无规则卷曲；c．端保守区氨基酸则主要形成a螺旋、B折叠和B转角； 四种构象单元中，a螺旋和B折叠含量很少，B转角较丰富。此外，在三个基因中共发现 百万年，而A。和A基因组的分化时间为3．98百万年。 关键词：粗山羊草、栽培一粒小麦、高低分子量谷蛋白亚基、SDS—PAGE、IEF 分子进化、二级结构、原核表达 ¨l 首都师范大学博上论文 Abstract The arcthe ofwheat consistof components glutenins major storageproteins，which glut