贝类派琴虫原位杂交检测技术地研究.pdfVIP

摘 要 派琴虫病 （Perkinsosis ）是严重危害全球贝类养殖业的主要疫病，也是进出口贝 类产品贸易中的重要检疫性疫病，目前，世界动物卫生组织 （OIE ）将雷氏液体巯基 醋酸盐培养基 （RFTM ）培养法作为派琴虫 （Perkinsus ）检测的金标准，但其不能区 分腰鞭毛虫 （Dinflagellate ）；另外，鉴于我国口岸检疫现阶段普遍采用的PCR检测方 法存在假阳性率过高的缺陷；本研究通过采用随机引物标记法，制备派琴虫特异性核 酸探针，首次建立了派琴虫原位杂交(ISH)检测方法。探针标记效率检测表明，所制 备派琴虫核酸探针含量达到 100ng/µL；Southern bolt检验证实探针特异性强，与贝类 包拉米虫 （Bonamia ）、单孢子虫 （Haplosporidium ）等无交叉反应，为派琴虫属通用 探针；以OIE推荐的雷氏液体巯基醋酸盐培养基培养法作为标准方法，对实验室采集 的20份贝类样品进行派琴虫感染检测表明，本研究所建立派琴虫原位杂交检测方法的 诊断敏感性为90.9%，诊断特异性为100% 。 利用所建立的原位杂交方法，对实验室采集的蛤仔和牡蛎进行检测的结果显示， 我国黄海海域的菲律宾蛤仔和文蛤均有派琴虫感染，而牡蛎样品没有检出。贝类派琴 虫原位杂交检测方法的成功建立，既满足了我国口岸进出境贝类派琴虫检疫需求，也 为我国贝类养殖场派琴虫流行病学调查提供了技术支持。 关键词：派琴虫；核酸探针；RFTM 培养；原位杂交；检测 Study on In Situ Hybridization Detection Method of Clam Perkinsus Infection Abstract Perkinsus infection can bring great damage to shellfishery and cause significant economic loses in the world, so it is an important quarantine loimia. Ray Fluid Thioglycolate Medium (RFTM) assay is a gold standard recommanded by the Office International Des Epizooties （OIE ）to dectect the Perkinsus infection, but it can’t differentiate Dinoflagellate with Perkinsus as the former has similar characters with later after cultured in Ray Fluid Thioglycolate Medium(RFTM). Besides, the PCR assay usually applied in entry-exit inspection of China has a high false positive rate. In this study, In situ hybridization(ISH) method to detect Perkinsus was established by using random primer to prepare Digoxigenin (DIG)-labeled Perkinsus probe for the first time. The detection of Digoxigenin (DIG)-labeled Perkinsus probe content rate was up to 100ng/µL. By southern blotting analysis, the probe was specific enough to distinguish Perkinsus from Bonamia and Haplo