家蚕肠液AKP遗传的分析野桑蚕AKP基因克隆及研究.pdfVIP

家蚕肠液AKP的遗传分析及野桑蚕AKP基因 的克隆研究 特种经济动物饲养专业 硕士研究生 罗 英 指导教师:鲁 成 教授 摘 要 碱性磷酸酶广泛存在于各种生物体内，目前己从细菌、病菌、藻类、高等植物、昆虫、 水生动物、哺乳动物和人等各种生物体内分离得到，并己通过多种方式应用到实际中，如医 学、毒物学、核酸研究、免疫学、食品、化妆品及人、动物和植物许多疾病的检测等多个方 面。对人KP的研究，目前己有许多报道，作为药用人即，在韩国、日本等国己有产品。但国 内却很少.由于目前AKP分离纯化的工艺比较复杂，同时还要受到酶源的限制.因此开发新 的AKP来源显得尤为重要. 家蚕是一种重要的经济昆虫，也是分子分子遗传学研究中重要的模式生物。AKP作为家 蚕体内一种与其消化吸收、物质代谢和运输，以及其经济性状和生理状况密切相关的功能酶 己引起了国内外学者对其的广泛研究，但目前国内的研究主要集中于其理化性质、活性影响 因素等基础理论研究上，而对于其活性的大规模调查及其遗传方式，却未见相关报道研究。 国外虽然报道了从家蚕中肠内提纯的AKP的部分理化性质、动力学性质的研究结果，并克隆 了AKP全基因，但到目前为止，尚未发现有关直接应用家蚕AKP方面的研究报道。本研究通 过对西南农业大学家蚕基因库84个家蚕品种及遗传系统肠液AKP活性进行调查.发现某些家 蚕品种具有极高的AKP活性，而这种家蚕AKP将有可能直接用于大规模生产，所以对其进行 分离纯化，研究其性质和特点具有重要的研究价值。基于此种思考，本研究首先根据调查结 果，筛选出AKP活性高的品种与活性低的品种进行杂交组合.分析了其遗传规律，然后进行 了家蚕肠液AKP的分离纯化，对其基本理化性质及功能基团的特点进行研究. 家蚕与野桑蚕的血缘亲近，野桑蚕作为丰富的野生蚕业资源，是可开放利用的宝贵基因 库资源;同时也是研究家蚕分化起源的重要材料。迄今己对野桑蚕进行了广泛而深入的生物 学上的研究、染色体的结构及变异研究、NDA多态性研究、在家蚕育种上的应用研究以及作 为桑园害虫防治上的研究。但因其茧层薄，茧丝短，尽管目前对野桑蚕的研究己比较深入， 但仍受到一定限制.近年来，随着分子生物学的发展，有关野桑蚕及家蚕的分子系统学研究 也取得了一定的进展，对其基因水平的研究也相继开展，例如丝蛋白基因、核糖RNA基因的 一 竺~~~~~~迢缨裂遴垫当夔奎 研究等，但是对于野桑蚕AKP基因的研究却末见报道.因此，本研究以野桑蚕为材料，根据 GenBank中己公布的家蚕AKP全基因序列，遵照特异引物设计原则，设计相应的引物，克隆 了野桑蚕AKP基因的部分序列，并将其推定氨基酸、ONA,DNA序列与家蚕及其它物种的相 应序列进行比较分析，从而分析它们的关系及进化机制。 现将研究结果分别报告如下: 1.活性调查及遗传分析 通过AKP活性调查研究，结果表明家蚕AKP活性是受多基因支配的，而且有主基因控制， 同时发现了高AKP活性并可能有应用前景的品系。根据AKP活性调查结果确定进行杂交组合 和分离纯化的实验材料。在杂交组合的14区中随机取样，分别取每头蚕的消化液，然后测酶 活性，进行遗传分析，实验结果表明:AKP活性遗传方式具有显著的数量性状特征，在受到 微效多基因控制的同时也存在主基因的作用:其活性与家蚕性别有一定的关系，推测认为在 家蚕的性染色体上可能存在影响AKP活性很强的基因。 2分离纯化 对高活性品种的肠液AKP进行分离纯化，依次经过DEAE-琼脂糖柱层析，SephacrylS-200 凝胶柱层析，然后将分离得到的AKP透析、干燥，进行酶纯度鉴定，纯化的AKP经等电点聚 焦电泳和SDS均显示一条蛋白带，表明纯化的AKP蛋白质是均一的。最后纯化倍数为 200.92，活性回收率为85.49%e 3.性质研究 将纯化的AKP样品经SDS,测得其亚基分子量为57950KD;经等电聚焦电泳测得其 等电点为4.7;其最适训为10.5,州稳定范围为7-12;最适温度为60C:以磷酸苯二钠为 底物，测得其Km值为1.5mmol/L, 用修饰剂PMSF,DTT,PCMB,NBS,BrAc,IAc,SUAN和TNBS选择修饰家蚕AKP的儿种氨 基酸残基，并溯定酶活力变化，结