抗牛精子膜蛋白单链抗体基因克隆表达.pdf

摘 要 由于精予膜蛋白结构上的多形性、功能上的复杂性，加之缺乏有效的分离纯化手段．有关精 子膜蛋白的研究一直是一个难点。spl8是由本实验室首次发现的一组牛精子膜蛋白，由于尚未纯 化得到spl8。有关spl8的研究难以突破。为此，本研究从分泌抗spl8单抗的杂交瘤细胞入手，欲 克隆其抗体基因并分析其序列特征，以此推测其针对的抗原性质。 应用重组噬菌体抗体库技术，从分泌小鼠抗牛精子spl8抗体的杂交瘤细胞系中分离总RNA， 克隆抗体重链和轻链可变区基因，加入连接肽引物(Linker chain fragment I酶切。回收后与pCANTABSE载体 variable)基因并用Rs引物进行扩增，．跏I、Not 噬菌体表面。蛆牛精子作为包被抗原，经过三轮“亲和吸附一洗脱一扩增”的淘选后，进行 隆。取阳性重组噬菌体抗体克隆株pCSAI，PCRj旷增其ScFv基因，筛选重组子进行序列测定，发 现其序列符合小鼠抗体基因的一般特征，并且与几株抗磷酸胆碱的抗体重链和轻链可变区序列的 同源性达80Y,以上；推测pCSAIScFv针对的抗原是磷酸胆碱类物质。将pCSA]ScFv基因克隆到 菌体总蛋白含量的30％。这些结果表明，本研究成功获得了杂交癯细胞的单链抗体基因，并且在 大肠杆菌细胞中得到了高表达；推测抗spl8单抗针对的抗原可能是磷酸胆碱类物质。 精子蛋白种类繁多，为了进一步研究牛精子蛋白功能。本研究欲构建一个针对牛精子的噬菌 体抗体文库。首先用牛精子免疫雌性四周龄BALBIctJ、鼠，从其脾脏组织分离总RNA，应用重组 噬菌体抗体库技术，构建了一个针对牛糖子的噬菌体抗体文库。经PcR{盘铡，计算文库的有效库 现．该单链抗体克隆的序列符合小鼠抗体可变区的一般特征，这说明构建的针对牛精子的噬菌体 抗体文库是成功的。 本研究成功获得了杂交瘤细胞的单链抗体基因，并且推涓抗spl8苹抗针对的抗原可鳃是磷酸 胆碱类物质：成功构建了针对牛精子的噬菌体抗体文库，为日后牛精子蛋白的功能研究与应用研 究奠定了一定的基础。 关键词：spl8，ScFv构建，噬菌体展示，磷酸胆碱，表达，牛精子t噬菌体抗体库 Abstract ItWasdifficultto role confirmthe membrane mammalianfertilizationand ofsperm proteindudng embryogenesisfortllemultipleconfiguration andlackofpudftedproteinofspermmembrane proteins． Inour studies，theroleof onthe headofbull previous family primaryspl8 proteins，located sperm post Was described．Inthe ofmonoclonal plasma expresslibrary ScFv presentstudy,the antl-spl8fsing／e Chain and Fragment isconstructedselectedforfurther of 8 on Vmhble)gene studysp