蚯蚓组织中新型DNA酶样物质分离纯化工艺及研究蛋白质组技术方法应用.pdfVIP

盥垩型兰逃警型；塑兰一————————型塑鎏拦监 摘要 本课题运用蛋白质色谱纯化技术对蚯蚓组织中的新型DNA酶样物 质进行了系统、全面的色谱柱上色谱行为分离纯化研究；并通过应用最 新现代生物信息学、蛋白质组技术体系对此酶的部分信息结构进行了鉴 定。 一．蚯蚓组织中新型DNA酶样物质色谱柱上色谱行为分离纯化研究 I的酶活力定义作为新型DNA酶 利用Kunitz、Yasuda等对DNAse 样物质的活性检测体系；通过对此酶特殊的理化特性研究，首先经过糖 溶法、选择性酸变性、热冲击变性、乙醇沉淀等物理方法完成高效粗分 级分离制备，去除了大部分杂蛋白，实现从复杂的样品体系中大量、快 Biosciences公司的AKTA 速的捕获目标蛋白；然后利用Amersham Selection Kit和XK系列层析柱研究蚯蚓组织中新型DNA酶的色谱行为 与分离特性。 DEAE Fast Flow弱阴离子交换层 结果：研究确定Hitrap Sepharose 6Fast Flow(10w 析、HitrapPhenylSepharose sub)疏水层析以及sephacryl S-200为该酶最适色谱分离填料，分离得到2．4KD大小的电泳级纯度新 型DNA酶样品，并以此制定了一种高效快速、稳定合理的精纯化工艺路 线。 二．蚯蚓组织新型DNA酶样物质快速、精确的蛋白质组技术方法应用 从SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳上切下分离得到的目的蛋白条带进行胰 蛋白酶胶内酶解，经过脱色、肽提取、Matrix混合然后经MALDI．TOF．MS 获得酶解后肽片段的肽质量指纹图谱(PMF)及一组肽分子量数据信息， 利用MASCOT通过SWISS．PROT数据库检索对目的蛋白进行鉴定，通 过MOWSE评分方法在未能得到准确匹配识别的前提下进一步利用纳升 电喷雾串联质谱(MS／MS)进行自动数据依赖性扫描，选定母离子经碰 撞诱导裂解(CID)产生串联质谱谱图，与NCBI数据库中肽序列的理论 串联质谱谱图进行对比检索鉴定蛋白质，同时对母肽进行原始MS／MS IIOVO peptide 谱图的解释确定获得重新测序(de sequencing)。 结果：通过MOWSE评分方法主要获得两组匹配： serine 3．4．21．·)F-I-0 proteinase(EC trypsin—like 1．gil543530，Alkaline ．earthworm(Lumbricusrubellus)(fragment) I polymerasesecond—largest 2．gil3668171，RNA crassa) 检索结果初步显示为一种新蛋白，分子量为24169．34。检索所得有 意义匹配肽段为蚯蚓体内的一种小分子肽，分子量为2508，为一种碱性丝 氨酸蛋白酶样物质，由此可以初步判断出这种新型蛋白质中含有部分丝 氨酸蛋白酶样(earthworm)结构序列功能：同时在其相似匹配中有部分 RNA聚合酶I序列特征，由此初步判断这种新型DNA酶样物质中的部 分序列与RNA聚合酶I有序列同源性。但其全面、具体的结构与功能尚 有待于做进一步的研究分析确定。该蛋白为蚯蚓组织中提取的新型DNA 酶样物质。 总之，本课题通过对蚯蚓组织中新型DNA酶样物质多重色谱技术研 究成功的探索出一条高效快速稳定的下游精纯