《副溶血性弧菌细胞猝灭及代谢物组提取方法的优化 Comparison of Quenching and Extraction Methods for Metabolome Analysis of Vibrio Parahaemolyticus》.pdfVIP

HuAxuE 第39卷 分析化学 FENxI 研究报告 第ll期 Chinese 2011年11月 Joumalof 1689～1694 Anal”icalChemist叮 DOl：10．3724／SP．J．1096．20l1．01689 副溶血性弧菌细胞猝灭及代谢物组提取方法的优化 赵强 刘海泉 卢瑛 孙晓红 潘迎捷 赵勇+ 上海海洋大学食品学院，上海201306 摘要 以气相色谱一质谱联用 Gc—MS 为分析方法．比较了液氮和75％甲醇 一80℃ 两种溶液对副溶血性 弧菌细胞的猝灭效果。以及氯仿、75％冰甲醇、水、甲醇一氯仿一水 10；3：l，y／y 、甲醇一氯仿一水 3：l：l。y／y 、甲 醇一氯仿 1：l，V／V 6种提取剂对副溶血性弧菌代谢物组的提取效果。结果表明。片j75％甲醇 一80℃ 猝灭 副溶血性弧菌时，出现-r代谢物泄漏现象，而液氮猝灭则不存在这个现象；检索发现，采用75％冰甲醇提取获 得了47种代谢物，峰面积标准偏差为8．02％，其它5种提取剂获得代谢物种类少于40种，且重现性差。比较 色谱峰数量、面积和重现性后发现，液氮猝灭、75％冰甲醇提取适于副溶血性弧菌代谢物组提取。 关键词 副溶血性弧菌；猝灭方法；代谢物组提取方法；气相色谱一质谱联用 引 言 代谢组学通过定性与定量研究生物体内代谢物的变化研究生物体代谢途径，代谢组学主要关注分 子量小于l000的小分子”】。目前，代谢组学的研究已在药物研发12】、代谢成分研究、疾病检测13一、生物 标志物寻找叫等方面展开。近几年代谢组学在微生物研究中迅速展开，已对部分微生物代谢物提取方 法进行了优化卜9】，并研究了猝灭过程中的冷休克现象㈣。 副溶血性弧菌是一种常见的食源性致病菌，由该菌引起的食物中毒事件占细菌性食物中毒事件 60％以上”“。代谢组水平研究是副溶血性弧菌的致病机理的重要研究内容。本研究对副溶血性弧菌细 胞猝灭及代谢物组提取方法进行了优化，为副溶血性弧菌代谢组学分析奠定了基础。 一 2 实验部分 2．1仪器与试剂 科技股份有限公司 ；He咖le 司 ；lpL色谱注射器 上海畦录贸易有限公司 ；Milli—Q制水系统 美国Millipore公司 。 甲醇、氯仿 分析纯，国药集团 ；胰蛋白胨大豆培养基 北京陆桥技术责任有限公司 ；副溶血性弧菌 ATCC33846 中国科学院微生物研究所 。 2．2色谱质谱条件 sLBTM一5ms色谱柱 60m×0．25 mm×O．25¨m ；进样口温度280℃；分流比5：1，进样量lpL；载气： 氦气；溶剂延迟4min；载气流速：1．0mL／min，色谱柱初始温度120℃，保持4min，以3℃／min升至 270℃，保持10min。El离子源：温度，230℃；电子能量，70eV；四级杆温度，150℃；全扫描模式，扫描范 围m／218～800，扫描速度：20次／s。 2．3样品前处理 将副溶血性弧菌接种于含5mLTSB的试管 150mm×15 mm 中，在37℃，以180r／min摇床培养 lO mL h，至OD咖 O．8，连续活化2次，作为种子液。吸取200灶种子液，接种于含100TSB的三角瓶 250mL 中，在37℃，以180 r／min摇床培养12h oD鲫 1．O 。取2mL菌液于4℃8000r／min下离心 20ll一0l—Ol收稿；20ll—05-“接受 委重点项目 No．0座机电话号码00 资助 ． ‘ E_mail：yzhao@shou．cdu．cIl 万方数据 分析化学 第39卷 mL 5 min；另一组加1．O75％甲醇 一80℃ ，轻柔吸 min，弃上清液，一组加约1mL液氮，于冰上放置5 打均匀，于冰上放置5min猝灭，在4℃8000r／min下离心5min，上清液用于检测代谢物泄漏；菌体沉淀 分别加3．0mL提取溶剂，180w超声波破碎2s，停止4s，超声60次。超声波破碎后溶液于4℃， 14000 r／min下离心lO h，加入30皿20 min，吸取500此上清液，30℃真空干燥6 g凡甲氧胺吡啶溶液， 60℃水浴l h，再加入45此MSTFA，60℃水浴lh。最后吸取1此上清液进行GC—MS分析。 2．4数据分析与统计检验 本研究采用NIsT、Origin8．0、Past1．79和SPSS13．0对实验结果进行分析，根据不同方法得到的色 谱总离子图中峰数量和峰面积判断不同方法的优劣。匹配度为样品质谱图与标准图谱的正检索相似系 数 O～1000 ，匹配度≥700为适合匹配度。可能性为样品质谱图与标准图谱的正、反检索相似系数的综 合，置信区间为≥80％。 3结果与讨论 3．1细胞猝灭方法比较 比较75％甲醇 一80℃ 与液氮两种溶剂对副溶血性弧菌细胞的猝灭效果。用75％甲醇 一80