绿针假单胞菌GP72中吩嗪抗生素合成基因簇克隆与产量提高.pdfVIP

绿针假单胞菌 GP72 中吩嗪抗生素的 合成基因簇克隆与产量提高 摘 要 绿针假单胞菌 GP72 （Pseudomonas chlororaphis GP72 ）是从上海郊 区甜椒根际土壤中分离筛选得到的一株具有生物防治功能的假单胞菌， 主要产生吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxilic acid, PCA ）和2-羟基吩嗪 （2-hydroxyphenazine ，2-OH-PHZ ），具广谱抗菌活性，可以有效抑制一 些植物病害的发生，但是野生型 GP72 的吩嗪抗生素产量相对较少。本 课题首次确定了 GP72 产生吩嗪抗生素的分子机理以及相关调控机理， 并通过对 GP72 的调控基因的改造，使其产生抗生素的能力得到了提高， 并且进一步明确了 2-OH-PHZ 的生成转化机制。 首先，从与 GP72 亲缘性相对较高的菌株的基因结构入手，在基因 的保守区设计引物，成功克隆出了 GP72 中的整个吩嗪相关基因合成簇， 并且采用半随机PCR 的方法测得基因簇中上下游未知序列以查证整个基 因簇的完整性。GP72 的吩嗪相关基因合成簇一共包含 10 个基因，分别 是群体感应调控基因phzI 和phzR ，PCA 合成基因phzABCDEFG ，以及 2-OH-PHZ 合成基因phzO 。实验获得 12418bp 的基因序列，为将来GP72 的深入研究打下了扎实的基础。 其次，运用分子生物学方法构造了 GP72 中吩嗪抑制基因rpeA 的突 变菌株 GP72AN，证明了rpeA 基因的突变对于 GP72 中吩嗪类抗生素有 II 一个明显的促进作用；并且在突变实验中检测到了 2-OH-PHZ 合成的中 间产物2-OH-PCA ，明确了以PCA 为前体，转化生成 2-OH-PCA ，并最 终产生 2-OH-PHZ 的合成路径。 同时，还构建了phzO 基因突变株 GP72ON，以及rpeA 、phzO 双突 变株 GP72ANON，实验表明 GP72ON 以及GP72ANON 均不产生 2-OH-PHZ 以及2-OH-PCA ，证明了phzO 基因对于反应的关键性的催化 作用，进一步明确了 2-OH-PHZ 的生成机制。 最后利用基因突变菌株进行发酵实验，并通过发酵方法的一些改良， GP72 中抗生素的产量获得了很大的提升。野生型GP72 的PCA 产量从 30 ppm 提升到了 960 ppm，2-OH-PHZ 的含量也从原来的 5 ppm 提升到 了约 170 ppm。 关键词：绿针假单胞菌，合成，基因，调控, 吩嗪-1-羧酸（PCA ），2-羟 基吩嗪 （2-OH-PHZ ） II CLONING OF PHENAZINE BIOSYNTHESIS GENE CLUSTER AND IMPROVEMENT OF THE PHENAZINES PRODUCIVITY IN PSEUDOMONAS CHLORORAPHIS GP72 ABSTRACT Pseudomonas chlororaphis GP72, isolated from the green pepper rhizosphere, is an effective root-colonizing bio-control agent against soil-borne pathogenic fungi on crop plants. This capability is primarily depending on its ability to produce two different types of antibiotics, phenazine-1-carboxylic acid (PCA) a