脑膜炎奈瑟氏菌荚膜抗原基因簇研究和遗传分型方法的建立.pdf

摘要 摘要 I 脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)是专性人类寄生的革兰氏阴性致病 菌，可以引起脑膜炎和败血症等，由于它的致畸率、致死率和发病率一直较高， 所以这种细菌引起的传染病一直是人类健康的巨大威胁。鉴于脑膜炎奈瑟氏菌 的重要性，有必要对它进行比较深入的研究。脑膜炎奈瑟氏菌主要是通过空气、 飞沫和密切的接触进行传播，呼吸道首先接触到这类细菌。在大约10％人的鼻 腔中携带脑膜炎奈瑟氏菌并且不致病，一旦这种细菌有机会穿过血脑屏障进入 血液或者是脑脊液就会引发严重的传染性疾病。 脑膜炎奈瑟氏菌的细胞外覆盖的荚膜是重要的毒力因子，根据脑膜炎奈瑟 氏菌的荚膜成分和免疫反应性等特点，将脑膜炎奈瑟氏菌分为12个血清群，即 W135， X和Y血清群的菌株引起90％以上的感染，属于常见的血清群，而其 余的几个血清群常被称为稀有血清群，它们引起的只是零星的感染或者是处于 携带状态。关于常见血清群的报道要比稀有血清群的多。A、B、C、29E、W135， X和Y血清群的菌株荚膜基因簇序列可以在GenBank数据库中找到，而H、I、 K、L和Z等血清群菌株的荚膜基因簇至今还没有破译，这对于针对荚膜的疫苗 研发和针对防控的血清群的检测以及进化研究造成严重的障碍，所以有必要破 译H、I、K、L和Z等血清群菌株的荚膜基因簇，分析它们荚膜基因簇内的基 因功能，特别是荚膜多糖的合成和转运基因，它们的序列对于种和血清群的检 测十分必要。 本研究的首要任务利用鸟枪库破译了H、I、K、L和Z等血清群菌株的荚 膜基因簇，分别得到了23，488、24，676、27，709、18，453和21，871 bp的序列， 注释出来与这些序列相对应的开放阅读框分别是19、18、22、14和15。通过 Clustal X的比对发现I和K血清群的荚膜基因簇序列一致性达到了99％，而它 们的荚膜多糖成分所有不同，所以推测造成荚膜多糖成分不同的一个异构酶基 摘要 成分，它们的基因种类和功能也有一定的相似性。在序列和基因种类比较的基 础上，本研究分析了脑膜炎奈瑟氏菌的荚膜基因簇的整体进化特点。 本研究的第二个任务就是利用血清群特异性的基因和脑膜炎奈瑟氏菌的种 特有基因，开发了能够检测所有12个血清群的多重PCR实验，连续使用三个多 重PCR可以区分全部的血清群，多重PCR实验还可以把血清学上分不了群的菌 株通过这种遗传学的方法直接分群。在检测中能够快速有效地区分稀有血清群 和不可分群菌株的血清群类型。每个被检测的脑膜炎奈瑟氏菌都应该得到三个 扩增子，其中的一个扩增子是利用条带大小不同来区分血清群，另外两个条带， 即ctrA和porA都是鉴定种，排除亲缘关系比较近的淋病奈瑟氏菌和嗜乳糖奈瑟 氏菌。 用于分群检测的多重PCR实验的性能要用准确性和灵敏度来验证。97个己 知血清群的临床分离脑膜炎奈瑟氏菌株对多重PCR准确性进行检验，得到准确 率为100％。46个未知血清群的临床分离株作为多重PCR的双盲实验标本。最 后的多重PCR试验的结果和血清学上的分群结果进行比对，结果是准确率达到 了98％。 经过多次的重复试验，最后确定了基因组DNA和在非培养条件下的模拟临 床脑脊液标本中菌株数量的灵敏度。本研究所有的血清群的基因组DNA的灵敏 度是lng／209L，相当于4x105个基因组数量。非培养模拟脑脊液标本的灵敏度 是-3x105CFU／m1，可以直接用于临床脑脊液标本或者是菌株基因组DNA的分 群检测。 II 于革兰氏阴性细菌。在自然界分布很广，是肠道的正常菌群，大多数不致病， 属于条件致病菌。大肠杆菌细胞外有三种形式的抗原，即菌体(O)、荚膜(K) 和鞭毛(H)等抗原。由于菌体外的脂多糖的结构类型很多，仅菌体抗原(O抗 原)的种类就有180多个血清型。 大肠杆菌在免疫力低下等情况可以引起肠道感染、粘膜感染和泌尿生殖道 感染，还可以引起猪、牛和羊等家畜的疾病。脂多糖是大肠杆菌细胞外的主要 表面成分，对致病性有很重要的作用，它的组成由核心多糖、O．特