鱼类诺达病毒对军曹鱼的致病性及重组疫苗研究.pdf

鱼类诺达病毒对军曹鱼的致病性及其基因工程疫苗的研究 摘要 nodaviI髑)是多种养殖鱼类的重要病原，给养殖业造 鱼类诺达病毒(piscine 成了重大损失。 necrosis vims)为研究对象，通过肌肉注射、浸泡和和共浴三种感染途径研究了鱼 类诺达病毒对军曹鱼m吐弦绷加刀c口开口如明)仔鱼(平均体重约3．69)的致病性。 结果表明，三种方法都能导致军曹鱼仔鱼发病，病鱼临床症状典型，如食欲减退、 活动力下降、体色发黑、部分鱼做螺旋状或亢奋游动等。肌肉注射组、浸泡组和 共浴组的累计死亡率分别为78％、44％和32％。采用逆转录．聚合酶链式反应 (RT．PCR)技术在患病鱼的脑、眼、脊髓中均能检测到诺达病毒，而在其它器官(鳃、 肠、肝、脾、肾和肌肉)没有检测到，在肌肉注射组中检出病毒的时间最早、检出 率最高；在共浴感染组和浸泡组检测到病毒的时间较晚，检出率较低。然而，在 无临床症状的幸存个体中也检测到该病毒的存在。通过组织切片在光学显微镜下 观察到患病鱼的脑、视网膜、脊髓都有明显而密集的空泡坏死病变，这是其它易 感鱼类感染该病毒后的典型病变。实验表明军曹鱼仔鱼是鱼类诺达病毒坏死病是 易感种群，肌肉注射感染发病急、死亡率高；浸泡感染和共浴感染发病慢、死亡 率低，该病毒在军曹鱼仔鱼中能够水平传播。 本文还根据RQ心Ⅳ的RNA2的ORF核苷酸序列，设计了一对特异性引物， A—MCP， 基因连接到表达载体pRsETA质粒中，构建了重组表达载体pRSET 经PCR、双酶切和测序等方法验证了目的基因连接的正确性。将其转化大肠杆菌 养基、不同温度和不同pH的条件诱导表达，。进一步优化了表达条件，结果该重 组菌在SoB和LB培养基，pH7．O，37℃条件下表达量较高，表达的融合蛋白主 要以不可溶的包涵体形式存在，提取的包涵中融合蛋白含量占60％以上，经柱层 析纯化蛋白，纯化度达90％以上。 采取亲和层析和SDS—PAGE割胶两种方式对表达的融合蛋白进行纯化，分 别将两种方式纯化的融合蛋白做抗原来免疫新西兰兔制备多克隆抗体。结果显示， 经SDS．PAGE割胶纯化蛋白作为抗原制备的抗体效价为1：6400。经柱层析纯化 产生的蛋白免疫产生的血清效价为1：12800。经w髓t锄．blot检验，两种纯化蛋 白产生的抗血清都具有特异性。 幼鱼(重约8．69)。免疫分为一次免疫组(A)、三次免疫组(B)和对照组(C)。 在A组和B组中按照分别免疫10Ⅳ尾、50pg／尾、100p∥的剂量依次分为A1、A2、 其中A2组的相对存活率和相对保护率分别为31％和28％，三次免疫组B的死亡率比 和发病率也均比对照组C低。B2组的相对存活率和相对保护率分别高达54％和56 ％。B2组和C组，累计死亡率呈现极显著差异，PIo．0l，B2组和C组发病率呈现显 著差异，PO．04。两个免疫组间比较，三次免疫组B的死亡率和发病率均比一次免 疫组A低。而且对于免疫的剂量而言，也存在差异，免疫注射剂量并不是量越大越 病死亡个体中检测的阳性率各组均为100％，在幸存个体的检测中B2组的阳性率只 有60％，Al，卫3组的阳性率为80％，而对照组的检测率则高达100％。 关键词： 鱼类诺达病毒；军曹鱼幼鱼；基因工程疫苗；抗血清 IIl Piscine Finnsh Marine Noda订rus’Pathogenici锣to ItsRecombinantVaccines R口c砂c绷自憎刀伽刀口dk朋And DeVelopment ABSTRACT The for pisci鹏舯da、，imsis锄impon柚t舐olo西calag胁t m锄y伽lturedfi