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电生理学发展简史（三） ? ??????1973 年， Anderson 和 Stevens 利用波动分析（也称噪声分析）结合电压钳技术研究了天然细胞膜上单个离子通道的特征，他们在蛙骨骼肌终板区成功地分析了 N 2 - 型乙酰胆碱受体阳离子通道的单通道电导和平均开放时间，所得数值与后来经膜片钳测定的数值非常接近。 ??????人工脂膜和波动分析取得的成果极大地鼓舞了生理学家去探索更合适的方法来直接从生物膜上观测单个离子通道的电活动，以揭示生物电信号的微观世界。要实现这一目标，首先要解决的就是背景噪声问题。单通道电流仅 1~2pA （图 5 ），而背景噪声要大得多，例如用细胞内微电极在肌纤维做电压钳时，膜在安静状态（无乙酰胆碱）下的噪声峰 - 峰值可达 200pA ，因此要想记录到单通道电流至少要使背景噪声减少 100 倍，而要精确测量则至少要降低 1000 倍。根据 Johnson 噪声公式，膜电流噪声的方差 σ 可由下式决定： σ=4KTfc/R ??????此处 K 为 Boltzmann 常数， T 为绝对温度， fc 为截止频率， R 为信号源内阻。按上式计算，只有膜电阻高达 2G Ω(2 × 10 9 Ω) 时噪声水平才能减低到可以观测 1pA 波幅和 1ms 波宽的信号，而要提高膜电阻，只能减少被测膜的面积，当被测膜面积小于 50μm 2 时，信号源电阻即可达 2GΩ 以上。这种思路引导 Neher E 和 Sakmann B 从细胞膜上游离一小片膜来实施电压钳，也就是要使只包含几个离子通道的小片膜在电学上与细胞膜的其它部分完全隔离，从而在不受细胞整体膜噪声的影响下实现通道电流的记录。他们用尖端直径几微米的玻璃吸管作为电极（尖端经热抛光，内充盐溶液），轻压在蛙去神经肌纤维膜表面，如果电极尖端的边缘与肌膜封接良好，就能实现小片膜在电学上与周围完全隔离的效果，如果封接不良，电极尖端边缘与膜之间就会产生漏流，同样会使噪声增大。因此，电极与膜的封接是膜片钳技术成败的一个关键因素。 1976 年 ， Neher 和 Sakmann 用这种方法完成了电阻为 50M Ω 的封接，并首次在细胞膜上记录到单通道电流。但是，当时实验记录的背景噪声仍然较大，电流的分析遇到困难。正当人们用各种方法加以改进未能奏效而几乎放弃努力时， Neher 于 1980 年在一次实验中偶然地向吸管电极内施加了一点负压（ 20~30cmH 2 O ） ， 封接电阻骤然增大了两个数量级，达到 10~100GΩ ，背景噪声显著减低（图 6 ）。后来将这种电阻大于 gigaΩ(10 9 Ω) 的封接称为 giga-seal 。 1981 年， Hamill 等在实现 giga-seal 的基础上建立了膜片钳记录的 4 种基本模式，即细胞贴附膜片、膜内面向外膜片、膜外面向外膜片和全细胞记录。在此基础上，以后又发展了许多新的记录模式，如穿孔膜片钳记录方式、巨膜片记录方式、松散封接记录方式、膜电容测定技术等，从而大大扩展了它的应用领域。 1991 年，膜片钳技术（ patch clamp technique ）的创始人 Neher 和 Sakmann 荣获诺贝尔生理学 或医学奖。 图6 膜片钳微电极与细胞表面紧密封接的形成 A ：微电极置于细胞面表形成 MΩ 的封接，记录电流噪声很大； B: 电极内施加轻微负压，封接电阻由 MΩ 级增加到 10 ~100G Ω ，背景噪声显著减低 ? ??????膜片钳记录的单通道电流（ single channel current ），使我们从功能上观测到了离子通道的活动，并且证实离子通道的活动是整个细胞电活动的基本单位。图 5 就是利用膜片钳技术记录的典型的单通道电流。可见单个通道的开闭是全或无式的，每次开放可产生皮安级（ pA ， 10 ~ 12 安培）的电???，每次停留于开放或关闭状态的时间是随机的。由于开、闭状态之间的转换速度非常快，因而单通道电流都表现为一个个宽窄不同的方波。利用计算机将大量单通道电流叠加平均后所得的总体平均电流（图 7 ），与在全细胞或一段神经纤维上经典电压钳技术记录的膜电流，也称宏膜电流（ macroscopical current ），非常相似，说明宏膜电流就是许多随机开放的单通道电流总和形成的。因此，利用膜片钳对单通道活动的研究，揭示了动作电位期间膜电导的变化，以及由此引起的膜电流变化，都是膜上不同种类的、大量的离子通道的开放和关闭造成的。 图7 单通道电流与总体平均电流 A ：电压钳制程序； B ： 9 次钳制脉冲下记录到的单通道电流； C ： 300 次钳制脉冲记录的总体平均电 ?