食管鳞状细胞癌差异表达基因及其临床意义.pdfVIP

中文摘要 前期研究发现的在食管鳞状细胞癌中表达明显上调的基因中选取CASG3B、 和免疫组织化学SP法检测它们在食管鳞状细胞癌组织中的表达，探讨它们与食 管鳞状细胞癌侵袭、转移的相关性。 2．资料与方法 2．1患者和样品 45例人食管鳞癌组织标本均来源于河南省肿瘤医院2008年7月-2008年11 月手术切除的食管鳞状细胞癌患者。其中，男性31例，女性14例。年龄47．75 岁，平均年龄为62．4岁。有淋巴结转移27例，无淋巴结转移18例。均在河南 省肿瘤医院接受外科治疗。术前所有患者均签署知情同意书。术前均未接受放 化疗。该研究计划方案经过郑州大学医学伦理学术委员会批准。所有食管鳞状 细胞癌的诊断均得到至少两个有经验的病理医师出具的组织学诊断。依据UICC 第7版TNM分期系统进行食管癌分期。 原发肿瘤组织和正常食管粘膜上皮组织(距肿瘤边缘大于5cm)，在离体后 立即置入RNALater液中保存，并移入．80℃深低温冰箱中保存。 2．2RNA提取和基因芯片分析 首先，对其中4例患者原发肿瘤组织和正常食管粘膜上皮组织进行基因芯 片分析。 采用TRIzol试剂，按照厂家建议的步骤进行全RNA提取；然后，使用分光 T0tal 光度计进行定量；cRNA的扩增和生物素标记使用IlluminaPrepRNA扩增 streptavidin．Cy3(Amersham Illumina公司的theSentrix and BeadStation芯片分析系统进行基因表 BeadChip 达分析。杂交、标记、染色、背景噪音及每条芯片上“看家”基因表达的基础水平 Ⅱ 中文摘要 件进行图像分析。 2．3差异表达基因的生物信息学分析 GX1 1．0(Agilent 从BeadStudio上获得的原始丰度数据输入到GeneSpring Technologies，SantaClara,CA，USA)上接受进一步分析。采用配对t检验以获得 在癌组织和正常食管上皮组织差异表达水平不少于2倍的探针集合(P0．01)。 进行平均距离法分层聚类分析，基于所有基因的经Log值转换的信号强度值， 采用Pearson中心距离度量作为衡量每个配对样本中基因表达模式相似性的手 GX 11．0上的基因本体分析选项检测所参与的最显著的生物 段。使用GeneSpring GX。然后，用所发 学过程。将BioPAX通路／网络转换方程输出到GeneSpring 现的最显著的细胞通路工具去确定哪一个生物学通路中存在差异表达基因目录 GX软件上，采用前述方法进行基因集合分析。 中基因的富集。在GeneSpring 2．4 SOS．PAGE和Western．blot 从前期研究发现的在食管鳞状细胞癌和正常食管粘膜上皮中表达明显上调 的前十位基因中选取分别选取CASG3B、IL24，表达明显下调的前十位基因中 在45例食管鳞状细胞癌组织中的表达。 将标本称量后，按照O．19加入5ml缓冲液的比例加入冰预冷的PBS，冰浴 条件下充分研磨，1000rpm离心5分钟，收集上清，每100I．t1分装一管。然后进 行SDS．PAGE和Western．blot，用兔抗人多抗来检测在不同标本中的表达情况。 每种都用甘油醛．3．磷酸脱氢酶(GADPH)作为内参照。 方法如下： SDS．PAGE结束后，将凝胶转移到转移缓冲液中，按照同样的尺寸剪好PVDF 膜，先在甲醇中浸泡5秒，与凝胶在转移缓冲液中共同孵育10分钟； 将PVDF膜与凝胶夹在Whatman滤纸中，放入转移电泳槽，稳压200mA， 持续转移4个小时； 配置的5％BSA封闭30分钟，每10分钟晃动一次； 用充足的PBST洗膜三