RNA干扰技术沉默STAT3基因对人肺腺癌A549细胞的生长抑制作用研究.pdf

抑制作用的研究 摘 要 生长抑制作用。方法：①以STAT3mRNA全基因序列作为模板，根据 siRNA的设计原则，从基因编码区起始密码子下游寻找符合设计特征 列，用BLAST软件进行同源分析证实为STAT3高度保守、与人类其它 基因无同源性后，采用化学合成法合成四条寡核苷酸链。设计的寡核 发夹结构，最后为siRNA作用序列的反向重复序列，3’末端加有转录终 止信号1]fr兀vr。②取等量的正负链DNA合成片段，退火得到目的双链 可直接用于与制备好的目的基因连接。将纯化的双链DNA片段定向克 点，利用重组DNA技术构建含目的基因的重组质粒 DH5a， 并将连接产物转化感受态细菌。将菌液涂布于含氨苄青霉素(终浓度 60p∥m1)的固体LB培养板上，倒置于37℃温箱中孵育过夜。连接成功 的重组体能在抗性培养板上生成单菌落，随机挑取生长良好的数个单 菌落于含有适量氨苄青霉素的LB液体培养基3ml中，置于37*(2摇床中 250rpm过夜。以小量质粒抽提试剂提取扩增后的重组质粒，即得到目 的表达载体pSUPER。经PCR初步筛选并进行DNA测序分析加以确定， 证实能在体内转录针对STAT3基因转录体的发夹状siRNA的表达载体 粒和脂质体按20：1的比例共转染肺腺癌A549细胞。同时设立空质粒 对照组及空白对照组。分别于转染24小时、48d,时、72dx时收集细胞。 量PCR技术检测sn玎3 mRNA的含量：在荧光显微镜下观察细胞的凋 亡情况。结果：(1)经PCR及测序鉴定，证实成功构建了针对STAT3基因 受到抑制，转染后第48h抑制率达高峰分别为75％、82．32％，而同时 空白质粒对照组及空白对照组比较无明显抑制作用。(3)荧光显微镜下， 粒增多，细胞碎片增加。结论：(1)本实验利用基因重组技术，针对STAT3 基因编码区、能在体内转录产生发夹状小干扰RNA(siI矾A)的真核 胞中，为进一步深入关于肺癌RNAi的实验研究及抗肿瘤的基因治疗奠 定了基础。(2)利用肺腺癌A549细胞株，在分子水平上，体内转录产生 的针对STAT3基因的siRNA可抑制肺腺癌A549细胞的STAT3mRNA的 表达，并抑制肺腺癌A549细胞的生长，促进其凋亡。(3)运用RNAi技术， 可以有效地抑肯IISTAT3的基因表达，诱导细胞凋亡，为肺癌的分子机 制研究和基因治疗提供了新的理论和实验依据，开辟了一条新的途径。 关键词：肺癌；STAT3；RNA干扰；基因治疗 ofSTAT3 vector-basedsiRNA Down-regulationexpressionusing ofhumanA549cells suppressesgrowth lung anRNAi that Abstract：0bjective：Todevelop approachspecifically theSTAT3 short genesequence targets by interfering to the effectof assessinhibitory onthe pSUPER——siRNA—。STAT3 ofA549cells．Methods：AsiRNA STAT3 growth targeting gene wasconstructedbasedon was sequence