δEF1在成骨细胞分化以及其乳腺癌细胞EMT中的功能的研究.pdf

摘要 摘 要 第一部分：8EFl抑制BMP一2诱导小鼠前成肌细胞 C2C12向成骨细胞分化的机制研究 8EFI隶属于一类转录因子超家族，该家族成员的结构特征为分子的N．端和 zinc cluster)，中间为同 type finger C．端各有一个krf2pple样锌指结构簇(krapple 序列结合而发挥转录抑制功能，可以抑制61晶体增强子、I型胶原pro．al启动 子、II型胶原Col2al启动子以及骨钙素基因的转录。8EFI在骨和胸腺组织中具 氨基酸的多肽，分子量约为120kD。8EFI基因敲除小鼠表现为胸腺发育缺失以 及多部位骨骼发育的严重异常。进一步研究证实8EFI羧基端737．1117氨基酸序 列主要参与调控胸腺的发育，氨基端1-727氨基酸序列参与调控骨骼系统的发 育，而且8EFI对成骨细胞分化的负调节作用并不仅仅依赖于其转录抑制功能。 通过前期的高通量筛选实验发现，8EFI表达水平在rhBMP．2诱导的人间充 stem 质干细胞(human cells，hMSCs)向成骨细胞分化的早期被明 mesenchymal 显下调，提示8EFI可能是潜在的成骨细胞分化抑制因子。本文以8EFI为研究 对现象，利用定点诱变、碱性磷酸酶活性分析以及荧光素酶活性分析等技术， 初步阐明了8EFI对成骨细胞增殖、分化的调控作用以及相关的功能定位、信号 转导途径等，对进一步阐明8EFI调控成骨细胞分化的分子机制以及开发用于骨 质疏松症治疗的小分子模拟肽药物具有重要的意义。 为初步证实8EFI对rhBMP．2诱导成骨细胞分化的抑制作用，本文首先利用 达质粒稳定转染至小鼠前成肌细胞C2C12，建立△8．FL稳定转染细胞系，并经 Western 胞，72小时后进行碱性磷酸酶(alkalineactivity，ALP)活性分析。 phosphotase 摘要 结果显示，rhBMP．2诱导的ALP活性被显著抑制在本底水平。除ALP活性外， 还检测了全长8EFl对另外2个成骨细胞分化标志性基因I型胶原和Osterix的 I型胶原和Osterix在mRNA水平的表达明显降低。上述实验结果进一步表明 分化。 目前对于5EFl转录抑制功能的分子机制主要是认为8EFl通过两端锌指结 构簇与被调控基因上游启动子中CA(C／G)(C／G)TG序列结合而实现的。为了探讨 前文中8EFl对BMP．2诱导成骨细胞分化的抑制功能是否也依赖于其锌指结构 pcDNA6B．6．M(缺失N．和C．端锌指结构簇)，并分析了分别稳定转染上述3种 抑制作用并不依赖于8EFl两端的锌指结构簇。 细胞的增殖与分化是成骨细胞形成过程中紧密关联的两个事件，本文利用 CCK．8方法证实全长6EFl过表达对C2C12细胞的增殖也有显著影响。结果显 示发现无论是否存在rhBMP．2诱导，△6．FL细胞的增殖速度都明显快于空载体 对照组。上述结果表明8EFl能够有效地促进C2C12细胞增殖，而且该作用不依 赖于BMP．2。 在初步阐明8EFl对成骨细胞增殖与分化具有调控作用的基础上，本文又对 与之相关的信号转导途径进行了探讨。鉴于经典的BMPs信号转导途径由Smads 介导，本文进行了一系列免疫共沉淀实验，发现5EFl不能够与Smadl、Smad4 与BMP／Smad信号通路并介导对BMP．2信号的抑制作用。为此，我们利用 MereuryProfiling PathwaySystems对{iEFl可能参与的其它信号转导途径进行了 探讨，发现6EFl能够特异性地调控AP．1和NF．r．B反式作用元件，可能通过参 与JNK信号通路和NF．rd3信号通路抑制BMP．2诱导的成骨细胞分化。 上述信号转导途径的研究为进一步探讨6EFl调控成骨细胞分化的分子机制 Ⅱ