中国野生葡萄芪合酶基因转化无核葡萄品种的研究.pdfVIP

中国野生葡萄蔑合酶基因转化无核葡萄品种的研究 摘 要 本研究以爱莫无核叶片、叶柄和无核白花药、子房等外植体为试材，通过器官发生 途径和胚状体发生途径建立了葡萄再生体系;并将携带有中国野生葡萄茂合酶基因的植 物表达载体pWR306，通过农杆菌介导法对爱莫无核叶片叶柄、长穗无核白叶柄、无核 白胚状体及胚性愈伤进行遗传转化，研究了潮霉素 (Hyg)筛选浓度、头抱霉素 (c)fe 脱菌浓度、农杆菌侵染浓度、预培养时间等遗传转化因素;并通过Hyg筛选、PCR检 测、5outhem杂交等方法对外源基因的整合进行了检测。取得的主要结果如下: 1.葡萄再生体系的建立 ()1器官发生途径再生体系的建立 以爱莫无核葡萄的叶片、叶柄为材料，通过研究不同激素浓度组合对外植体愈伤诱 导及不定芽分化的影响，建立了葡萄器官发生途径的再生体系。叶片再生适宜培养基为 MS+TDz25.mg’L，+N从 0.lmg ·L一，，再生率为21.57%;叶柄再生适宜培养基为 Ms钾Dzl.omg“，再生率为2.08%;不定芽伸长培养基为Ms+mzo.25mgL·，创从 00.1mg’口;生根成苗培养基为1/2Ms十BIAO.lmg ·L’l。 2()胚状体发生途径的建立 以无核白葡萄花药、子房为材料，研究葡萄胚状体发生途径的再生。结果表明:无 核白的花药和子房胚性愈伤组织诱导最佳培养基分别为Ms+BA4.mog·L-l+2，4一D 0.smg·L一1十3%蔗糖和Ms十BA40.mg·L’，+24，一1.mog·L一十‘蔗糖3鲍 ·L一，;胚状体 诱导培养基为Ms+BA4.mog·L一，+蔗糖390，L一，;在无激素的Ms培养基中胚状体很快 萌发;成苗培养基为认，M十蔗糖巧9，L’1。 2.遗传转化体系的优化 ()lHyg选择压的确定 以爱莫无核叶片和扩繁单芽茎段为试材，研究Hyg对葡萄叶片不定芽再生及植株 生长的影响，确定了Hyg筛选浓度和筛选方式。葡萄遗传转化后进行延迟筛选，并逐 步增加潮霉素的浓度，起始浓度为3mg·L一，再逐步增加至12mg·L一，可减少对再生的 抑制。 (2)脱菌素Cfe浓度的确定 以爱莫无核叶片为试材，研究Cfe对不定芽再生的影响，确定了Cfe的最佳脱菌浓 度为4omog·L一，。 (3)农杆菌侵染浓度的确定 分别以叶片、叶柄、胚状体和胚性愈伤为试材，研究在不同浓度农杆菌下脱菌的难 易，确定了不同外植体侵染时农杆菌的最佳侵染浓度。叶片、叶柄适宜的OD600值为 0.3~05.;胚状体为0.3~04.;胚性愈伤为0.3。本试验选取OD栩=0.3进行遗传转化。 (4)预培养时间的确定 以爱莫无核葡萄叶片为试材，研究叶片预培养时间对遗传转化的影响，确定叶片遗 传转化的最佳预培养时间为9天。 3.外源基因的检测 ()1潮霉素筛选 农杆菌介导法转化爱莫无核叶片、叶柄和长穗无核白叶柄，经潮霉素筛选后分别获 得71和82株抗性芽，爱莫无核抗性芽伸长缓慢，2个抗性芽成苗:长穗无核白共有83 个抗性芽生根成苗，成苗率为肠34%。 转化后的无核白小植株经潮霉素筛选后，共获得49个抗性株系。 (2)PCR检测外源STS基因的整合 分别对20个长穗无核白的抗性株系及选取的巧个无核白抗性株系进行PCR扩增。 结果有n个长穗无核白和7个无核白抗性株系扩增出约1288饰的特异条带，而非转基 因的葡萄对照无特异性条带出现。初步表明外源基因已经整合进植株的基因组中。 (3)Southem杂交 分别对PCR检测为阳性的5个长穗无核白株系进行Souhtem杂交检测，有1个株 系检测到一条杂交带，证明STS基因已经转入到葡萄基因组中。 关键词:葡萄;农杆菌介导;茂合酶基因;遗传转化;osulhem杂交 STUDYONTRANSFORMAT10NOFTHENOVEL REL户门夕EDTOSTILBEN卫SYTHNASEFROM CHD呵ESEVI兀店 创TOSEEDLESSGRAPES(竹乃心不晒幼华百凡咬L.) ABSTRACT TheregenreationSytesmsofEmera1dSeedlessnadThomPsonSeedlesswereestbalished byorgnao gneesisandsomat1cembryogene