中药附子反相高效液相和RAPD指纹图谱及质量评价研究.pdfVIP

中药附子反相高效液相和RAPD指纹图谱及质量评价研究 摘 要 附子为毛莫科植物乌头 (Aocnutimcar加纪加￡IiiDebx.)的旁生块根 (子根)，是我 国常用中药材品种之一，附子具有强心、提高免疫系统功能、抗肿瘤、抗心血管疾病、 抗炎镇痛及抗衰老等药理作用。本文研究了中药附子中有效成分的提取，对其成分的高 效液相色谱分离条件进行了优化，建立了附子鲜品及饮片的反相高效液相色谱指纹图 谱，在鲜品指纹图谱基础上对不同产地的附子中有效成分含量进行了比较，同时对附子 的RAPD指纹图谱进行了初步研究。 实验取得的主要研究结果如下: 1、比较了乙醚一氮水、氯仿、无水乙醇体系对附子中三种主要生物碱:乌头碱、 新乌头碱、次乌头碱的提取效率，并比较了冷浸、超声二种方式提取三种生物碱的提取 效率，在此基础上确定了提取方式和最佳提取时间。最终确定的提取条件为乙醚:氨水 (20:1，VV/)溶液超声提取20min。 2、比较了甲醇一水、乙睛一水体系对附子提取液的分离效果，并采用反相高效液 相色谱 (PR-LC)多台阶梯度优化方法对附子提取液的色谱分离条件进行优化。经优化 最终确定的色谱条件对附子提取液进行分离得到20个分离效果良好的色谱峰;用试验 对此优化条件的稳定性、精密度等进行了验证，试验结果显示了较好的预测精度和分离 度。本方法分离附子提取液的分析时间短且分离度高，显示了台阶梯度优化方法在确定 色谱分离条件上的优越性。 3、用一种新的多台阶梯度洗脱系统的PRLC法，首次建立了陕西汉中、四川江油、 安县、云南、贵州不同产地产附子药材的由01种成分组成的色谱指纹图谱。以乌头碱、 新乌头碱、次乌头碱为参照峰作为相对标准，对其质量进行了评估。研究了汉中四种不 同种质来源的附子指纹图谱差异，还提出用相对含量比较法对不同来源附子中01种成 分的含量进行了质量评价。本文所建立的附子药材的PRLC指纹图谱方法，从试样提取 的精密度、稳定性、图谱重复性等方面均符合 《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂 行)}} 中的有关规定。该方法具有重现性好，特征性强，方法简便、快速等特点，有可 能成为附子药材种属判断、质量评估的标准。 4、在建立可靠的附子药源植物乌头基因组DNA提取分离和RAPD一PCR扩增技术 体系的基础上筛选具有稳定的多态性的RAPD引物。利用RAPD标记检测4个地方类 群的附子药源植物的DNA遗传多态性，构建附子药源植物的DNA指纹图谱。筛选的 引物扩增条带清晰并具有5~61个多态性位点。利用琼脂糖凝胶电泳可以便捷地检测扩 增的DNA多态件。从11条RAPD随机引物中筛选出3条RAPD引物，确定了102多 个多态性位点，对四个类群的附子药源植物进行了RAPD分析并构建了DNA指纹图借。 说明构建的RAPD指纹图谱完全可以用于附子药源植物的鉴定。 关键词:附子:提取分离;梯度优化;乌头碱;新乌头碱;次乌头碱;反相高效液相色 谱;RAPD;指纹图谱 STUDIES0NF1NGERPR1NTOFHPLCANDRAPD TECHN0L0GYANDQUALITYEVALUAII0N0FTCM MONKSHOOD ABSTRACT Monkshood(R哪傲 aocntii alterali沙夕介争。r浏司 silhedaughterrootofAoc”左刀脚 mrac ic加e.liDebxofnaI’uunc 1acocusplnat，tisioneoflradtiionalChineesmedicnei城TC峋， 助dposessmanyphnanacologlcufnct1nos，suchascradoitonic，ebnancingmuunne baliiyt， 助d一ne叩aslm，anti一ardlovasucraldies暇，胡tl一niflmnal atoryalldnaalgecsi，natiaging厂r】115 paperofcuesdonhte ofllo诫ng points:xetractefficiencycomP0nents丘ommonkhsoo氏 叩U而ez阮 义praat1no ocnditionofhighperibn11naceliquidchromatography(HPLC)， c