若干中心代谢途径单基因敲除对大肠杆菌代谢影响研究.pdf

逝婆I大堂擅主堂鱼鲨塞 摘要 人类基因组计划的实行推动了大肠杆菌基因组测序的完成，为大肠杆菌突变 菌的构建和代谢研究提供了遗传学的基础。本文选取有代表性的中心代谢途径单 基因敲除大肠杆菌进行考察，包括lpdA、poxB、sucA和sucC基因敲除大肠杆菌。 其中，前两个基因编码连接糖酵解途径和三羧酸循环的酶，后两个基因编码三羧 酸循环酶。根据生长特性、基因表达、酶活、胞内代谢物浓度以及基于碳13标记 实验的代谢通量分析来考察这些单基因敲除对大肠杆菌代谢的影响。 tpda基因敲除大肠杆菌中丙酮酸脱氢酶复合体和0【一酮戊二酸脱氢酶复合体 均缺陷，该突变菌株的表型与野生菌有显著不同。在LB培养基中，利用葡萄糖 阶段，葡萄糖的利用速率降低，细胞生长缓慢，由于生成大量的丙酮酸，细胞产 率非常低；吸收丙酮酸阶段，产生D哥L酸、乙酸、琥珀酸和L谷氨酸。基于酶 活和胞内代谢物浓度的测量结果，发现丙酮酸的吸收是丙酮酸氧化酶和磷酸烯醇 式丙酮酸合酶．磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶共同作用的结果。通过丙酮酸氧化酶吸 收的丙酮酸被转化成乙酸然后通过乙酰辅酶A合成酶、磷酸乙酰转移酶．乙酸激 酶共同作用生成乙酰辅酶A来支持细胞的生长。lpdA突变菌中积累的丙酮酸在 基因表达水平和酶活水平激活了D哥L酸脱氢酶，造成了D．乳酸的积累。三羧酸 循环的中断激活了乙醛酸途径。L谷氨酸在突变菌中的大量积累是由于其前体代 谢物阻酮戊二酸的积累造成的。 poxB基因敲除降低了大肠杆菌细胞的葡萄糖吸收速率、细胞生长速率和生 物量产率，升高了大肠杆菌的氧气消耗速率和二氧化碳释放速率。丙酮酸氧化酶 的缺失并没有导致显著的丙酮酸积累，从这一点我们可以看出，有氧条件下丙酮 酸的代谢主要依赖于丙酮酸脱氢酶复合体，而丙酮酸氧化酶并不起决定作用。酶 活的测定结果表明丙酮酸氧化酶的缺失导致了中心代谢途径酶活的改变。poxB 突变菌在合成培养基中葡萄糖激酶酶活上升，但是由于其它一些糖酵解酶如6． 磷酸果糖激酶和1，6．二磷酸果糖醛缩酶活力的下降导致糖酵解途径的代谢通量 降低。在LB培养基中，三羧酸循环酶如柠檬酸合酶和苹果酸脱氢酶在poxB突 变菌中被抑制。丙酮酸氧化酶的缺陷同时也导致了6一磷酸葡萄糖脱氢酶和乙酰辅 酶A合成酶活力的升高。这说明该酶虽然在正常大肠杆菌的代谢中不起决定作 摘要 用，但还是具有一定的调节作用。特别是该酶在轫剃突变菌中起着非常重要的 作用，如果在加捌突变菌中如果抑制丙酮酸氧化酶，细胞停止生长。 sucA和sucC基因位于同一个操纵子sucA战D，均编码三羧酸循环酶。其中 sucA参与编码∞酮戊二酸脱氢酶复合体，sucC参与编码琥珀酰辅酶A合成酶。 虽然sucA和sucC基因拥有这些相似点，但是这两个基因的缺失对大肠杆菌代谢 的影响却有很大的差异。实验结果表明，三羧酸循环酶的缺陷并不一定都会影响 细胞的生长速率。J弘叫基因的缺失显著降低了大肠杆菌的生长速率，而sucC基 因的缺失并没有明显影响细胞的生长速率。sucA突变菌中的0c．酮戊二酸脱氢酶复 合体的缺失导致了甜酮戊二酸的积累，而在大肠杆菌中甜酮戊二酸是合成谷氨酸 的代谢前体，从而导致谷氨酸的积累。尽管sucC基因编码的琥珀酰辅酶A合成 酶负责催化舡酮戊二酸脱氢酶复合体的下游反应，但是并没有导致0c．酮戊二酸和 L．谷氨酸的积累。 sucA突变菌的葡萄糖吸收速率降低，乙酸的产量降低，并且能够吸收利用 乙酸。乙酸激酶在sucA突变菌中活力下降直观地解释了该突变菌产生的乙酸量 较少的原因，而糖酵解途径活力的降低揭示了乙酸产生量减少的根本原因是下降 的糖酵解途径的代谢通量。乙醛酸途径的显著激活实现了乙酸的再利用。与之相 对的是，sucC突变菌的葡萄糖吸收速率与野生菌相比并没有明显的变化，sucC 突变菌产生非常大量的乙酸但是并不利用产生的乙酸。乙酸激酶在sucC突变菌 中活力上升催化产生的乙酸量大大提高，乙醛酸途径并没有因为大量乙酸的生成 而被激活，乙酸根本不可能再被吸收利用。连续发酵中，全局调控基因faaR和 iclR在sucA突变菌中表达水平的降低促进了aceA基因的表达水平的升高导致了 乙醛酸途径的激活，而在sucC突变菌中表达水平的稳定，使得aceA基因的表达 水平与野生菌持平。全局调控基因area和．加r的基因表达水平在两个突变菌中的 降低，导致一些三羧酸循环酶的激活。 由于三羧酸循环被中断，sucA和sucC突变菌的氧化还原平衡发生了变化