人类ZO2蛋白质第二个PDZ结构域的溶液结构和功能研究.pdf

摘婴 摘要 这篇博士论文主要是对人类ZOI和Z02蛋白的第_个PDZ结构域进行了克 隆、表达，纯化以及结构和功能研究。我们克隆、表达、纯化TzoIjfnz02蛋白 的溶液结构，结果发现了一个新奇的PDZ结构域的二聚化模式，即通过三维空间 结构域交换形成了一二聚体。快速蛋白液相色谱(FPLC)及分析性超速离心(AUC) 都证明Z01一PDZ2及Z02．PDZ2均以二体的形式存在，且二聚体很稳定．因为用 沉降速率分析的方法未发现‘glf]有单体存在。此外，我们进行了体内免疫共沉 淀及体外的GST 作用，井月我f『J同时发现ZOI·PDz2和Z02．PDZ2自身也能相互作用。我们存体 外利用TDSS对蛋白进行了交联实验J司刚我们使用了动态光散射技术，结果表明 这两种蛋白在溶液中都存在不均一的聚集。这种ZO蛋自由PDZ介导的寡聚化可 能为claudins跨膜蛋白的聚合提供了结构基础。 在第一章中，我们综述了紧密连接和zO蚩白的结构和功能。上皮细胞和内 皮细胞在组织和不同的细胞间形成了选择件的屏障，它们发生了极化．且通过 细胞问的复合物互相连接，这些复合物包括紧密连接、粘性连接和桥粒。紧密 连接是连接复合物一fI最靠近顶点的成分．通过在细胞问形成连续的带状结构隔 离了顶点和侧质膜。紧密连接在调控离子通过旁细胞途径刚发挥重要的作用， 也是血脑屏障发挥功能所必需的，血脑屏障巾紧密连接若被破坏会导致很多神 经系统疾病的发生。 蛋白通过脚手架蛋白如zO蛋白与细胞骨架相连。ZO蛋白(ZO．I／ZO．21ZO一3) 属于膜相关的乌苷酸激酶家族(MAGUKs)，这些蛋白含儿个蛋白．蛋白相互作 ．叶j的结构域，包括三个PDZ结构域、一个SH3结构域和。。个GK结构域，它们主 要定何于连接复合物的膜下匣．把多个完整的膜蛋白交联到细胞质表而．产生 特殊的膜区域。 最近的研究已经揭示TZO蛋白相互作用的结构域。ZOl通过第二个PDZ结 MDCK细胞中有Z01同二聚体的存在，而且第二个PDZ结构域足二聚必需、充分 摘要 的条件。而在Umeda的研究tI，报道ZO]的SH3／GK模块是二聚必需的。 ZO蛋白的j：聚或寡聚在决定它们配体的性质方而起很重要的作用。Claudins 跨膜蛋白被看作是紧密连接的骨架，在参与跨细胞通道和孔的形成中，它们可 以同源或异源寡聚。ZO蛋白通过第一个结社J域结合至lJclaudinYv末端，二聚的 ZOl(可能．z02也是)不仅发动jclaudin聚合，即紧密连接的形成，也决定了紧 密连接的正确定位。 ． 在第一章中，我们叙述了ZOI—PDZ2及Z02．PDZ2得到了克隆、表达邱纯 化，Z02．PDZ2的溶液结构用NMR方法得到了解析。出乎意料的是，Z02．PDZ2 通过交换二维空间结构域形成了紧密的■重对称的同■聚体结构。这种■聚体 结构非常适合ZO蛋白在紧密连接中发挥紧密连接的功能。 Z02．PDZ2在J32a和132b区域独特的氮基酸序列很可能导致了返种三维守 问结构域交换的同二聚体的形成。前人的研究中已经发现了PDZ结构域的几种 的连接太短而小能折回到同一单体形成一对反’i，行的6片层，从而形成这种三维 空问结构域交换的结构。因为zO蛋白的第=个PDZ结构域有高度的保守性．我 们猜想这种三维空间结构域交换的缔构也同样适用于同二聚体ZOI．PDZ2和 Z02．PDZ2紧密的二聚体结构应归因于每个业皋N端的两个D．片层的交换，从 而产生众多的氢键和广泛的疏水相互作川。 此外，我们利用体外的GST pull．down和体内的免疫共沉淀实验来说明 Zol—PDZ2和Z02．PDZ2之问的相互作崩，我们证明它们住体外、体内均能直接 相互作用，同时，它们自身也能相互作用。利用化学交联和动态光散射．我们 推断Z01．PDZ2和Z02一PDZ2在溶液中二聚和寡聚形式共存。它们体外，体内 的相互作用及自身相互作用应该是由于它们同源或异源寡聚引起的，囚为它们 是紧密的二聚体。很可能是同二聚体互补的表面静电势使它们能进一步聚集。 我们猜测对于ZO蛋白在体内的寡聚或多聚，第二个PDZ结构域及SH3／GK结构 域都可能是必需的。 关键词：结构域交换，同二聚体／核磁结