苹果L-半乳糖脱氢酶基因全长cDNA的克隆及正、反义表达载体的构建.pdfVIP

苹果L一半乳糖脱氢酶基因cNDA全长的克隆 及正反义表达载体的构建 摘 要 苹果恤勿2公pmualiMLli)属蔷薇科蔷薇属植物。抗坏血酸 (AsA)俗称维生素C，在 植物抵抗氧化胁迫、增强光合保护、调节细胞的分裂、生长过程以及信号传递等方面都 具有非常重要的作用。最近几年对AAs在植物中的功能及AAs生物合成途径研究得较深 入，在此基础上，以提高植物中AsA含量为目的的相关基因工程研究将为进行提高农产 品中维生素C含量、改善农作物的营养品质、增强其抗逆性等方面的研究打下基础。 L一半乳糖脱氢酶是AsA合成的L一半乳糖途径中催化L一半乳搪生成L一半乳糖内酷的关 键酶.本试验以嘎拉苹果叶片为材料，通过RT一PCR法克隆了调控AsA合成的L一半乳糖 脱氢酶基因，进行了序列分析，并且构建了正义和反义表达载体。为进一步研究该酶的 分子结构、功能、表达特点以及通过转化研究植物合成和积累AsA的分子机制奠定了基 础。 本试验获得的主要结果有: 1.用Rl-’PCR法从苹果叶片中克隆出L一半乳糖脱氢酶的cDNA全长，其全长cDNA 序列包含一个长度为927bP的开放阅读框o(盯)，编码342个氨基酸。该片段与GenBnak 中其它植物的L一半乳糖脱氢酶基因核昔酸序列同源性分析表明该序列与称猴桃的同源 性为81%，与辣椒的同源性为80%，与菠菜的同源性为87%。 2.借助PMD18一T载体将L一半乳糖脱氢酶基因的完整ORf序列正向插入到植物表达 载体PsB166的多克隆位点上，构建了含有GalDH全长cNDA的植物正义表达载体。 并经酶切、PCR鉴定，己导入农杆菌. 3.将L一半乳糖脱氢酶基因的完整序列反向插入到植物表达载体PsB166的多克隆位 点上，构建了反义表达载体，并通过直接转化法将其转化入农杆菌EHA105。 关键词:苹果:L一半乳糖脱氢酶;基因克隆;序列分析;正义表达载体;反义表达载 体 ! 1 山 . 1 ， 几 . . . .