苹果、梨铁蛋白基因的克隆及菜豆铁蛋白基因在转基因苹果和番茄植株中的表达特性研究.pdfVIP

中文摘要 苹果、梨铁蛋白基因的克隆及菜豆铁蛋白基因在 转基因苹果和番茄植株中的表达特性研究 摘 要 铁蛋白是一种铁贮藏结合蛋白，广泛存在于植物、动物、微生物中，由42个亚基 组成450KD的巨大复合体，可以储藏结合4500个可溶、非毒性、可利用的铁原子， 在生物体内铁的代谢方面起着关健作用。 苹果是世界范围内广泛栽培的果树，但目前关于苹果铁蛋白基因的克隆和表达特 性的研究却很少。本试验研究了苹果和梨铁蛋 白基因和启动子的克隆，以及铁蛋 白基 因在转基因和非转基因苹果基因组中的表达特性，对转基因苹果基因组中铁蛋白基因 表达的影响因素进行了探讨，并利用番茄作为模式植物对外源铁蛋白基因在转基因苹 果基因组内的表达进行了预测。 1.根据 己报道植物铁蛋白基因(ferrtiin)的保守区域设计引物，用Rl-’PCR和RACE 的方法从 嘎‘拉，苹果你f口ul:odmestiacBrohk￡v’Gala，)叶片中获得苹果铁蛋白基因 (吞人2尸已r)的全长序列。该基因已被 GenBank数据库收录，登录号为DQO99429。该 Dc 卜A共含1403个碱基，编码区831bP，编码277个氨基酸残基的蛋白质，终止密码 子后有02b9p左右的3’端尾随序列区。通过GneBnak同源性比对发现，该基因与大 豆、肛豆、拟南芥、烟草、小金海棠、小麦、水稻、玉米铁蛋白基因氨基酸序列同源 性分别为85%、83%、82%、80%、57%、47%、27%、71%。Suothren杂交结果显示， Ferrtiin基因在嘎‘拉，苹果基因组中至少有7个拷贝存在。0.smM的柠檬酸铁处理嘎‘ 拉，苹果试管苗的茎段不同时间后的定量RT.PCR表明，该基因随着诱导时间的延长表 返量增加，说明嘎‘拉’苹果的铁蛋白基因在转录水平上受铁诱导表达。同时利用 Promotrewakling方法从嘎‘拉’苹果基因组中克隆出谧认艺尸已，的启动子序列。该启动子 序列具有 G一box、Blockll、sHs等铁蛋白基因启动子所共有的序列特征，并且在 一83一7b0p的位置与mZFerl启动子的IDRS(zIon一dependentRe即lationsequence)区 域同源性较高口 2.才民据 已报道植物铁蛋 白基因的保守区域设计引物，用Rl-’PCR和RJ)、CE的方法 从翠‘冠’梨 乃〔ur;PyrofjaliNkaaivcC‘ulugna，)叶片中克隆到四种铁蛋白基因的全长 序歹)‘。这四种基因已被GenBnak数据库收录，登录号分别为DQ417207、DQ417208、 DQ417209、DQ417210。第一种梨铁蛋白基因印Ferl的全长为795bp，编码265个氨 基酸残基的蛋白质，终止密码子后有92b2p的3’端尾随序列区;第二种梨铁蛋白基因 苹果、梨铁蛋白基因的克隆及菜豆铁蛋白基因在转基因苹果和番茄植株中的表达特性研究 乃沂己rZ的全长为91b5p，编码035个氛基酸残基的蛋白质，终止密码子后有180bP的 3’端尾随序列区;第三种梨铁蛋白基因印凡r3的全长为87b6p，编码622个氛基酸残 基的蛋白质，终止密码子后有928如的3’端尾随序列区;第四种梨铁蛋白基因PPFer4 的全长为92b4p，编码038个氨基酸残基的蛋白质，终止密码子后有51b7p的3’端尾 随序列区。四种梨铁蛋白基因之间的核普酸序列的同源性在 85.7%一904.%之间。 osuhtem杂交结果显示ferrtiin基因在翠‘冠，梨基因组中以多拷贝形式存在。并利用 Promotrewakling方法从翠‘冠’梨基因组中克隆出乃沂已;的启动子序列，该启动子序 列具有G一box、Blockll、sHs等铁蛋白基因所共有的序列特征，并且在一31小一一lbP的 位置与八侧凡:启动子的DIRS区域同源性较高。 3，以嘎‘拉’苹果的叶片为转化受体，应用超声波直接转导法将菜豆 (Phasoelus uvaglrsi)铁蛋白基因导入受体中。实验表明，以0.5W/c扩的声强、25℃、02mni超 声波处理的转化效果最佳，抗性愈伤组织的比例高达42%。抗性愈伤组织经诱导获得 了61个杭性株系，有n个株系表现出Gus 阳性，阳性比率为2.57%。经PCR检测， n个Gus阳性株系中有6个能扩增出目的条带;而suothemblotting实验表明，菜豆 铁蛋白基因在 2个苹果转基因株系的基因组中实