苹果[Malus domestica]DHAR基因cDNA全长克隆及其植物表达载体构建.pdfVIP

苹果脱氢抗坏血酸还原酶基因cDNA全长 克隆及其植物表达载体构建 摘 要 抗坏血酸作为一种重要的抗氧化剂，在植物细胞的酶促和非酶促反应中都具有重要 意义。为了维持抗坏血酸的抗氧化活力，它的再生就显得尤为重要。在抵抗氧化胁迫的 反应中，抗坏血酸自身被氧化为单脱氢抗坏血酸，一部分单脱氢抗坏血酸在单脱氢抗坏 血酸还原酶的催化作用下还原为抗坏血酸，另一部分单脱氢抗坏血酸的在歧化作用下被 不成比例地还原为抗坏血酸或氧化为脱氢抗坏血酸。脱氢抗坏血酸还原酶以谷肤甘肤为 底物，催化脱氢抗坏血酸还原为抗坏血酸，在循环利用抗坏血酸、保护细胞组分抵御氧 化损伤中发挥重要的作用。目前尚未见到从果树中克隆到脱氢抗坏血酸还原酶基因全长 的报道。 本试验以嘎拉苹果叶片为试材，克隆了脱氢抗坏血酸还原酶基因DcNA 全长并构建 其植物表达载体，为进一步转化其他植物、更好的研究其代谢途径以及在抗坏血酸一谷 肤甘肚循环中的作用奠定了基础。主要研究结果如下: 1比较了三种方法提取“皇家嘎拉”苹果叶片总RNA的效果，发现改进的十二烷基 硫酸钠一热酚法可提出高质量的RNA，且成本低廉，最终选定此法用于实验。 2.根据GneeBal水中己经登陆的几个编码苹果脱氢抗坏血酸还原酶基因cDNA片段 的保守序列设计两对引物，运用巢式PCR扩增到一个中间片段，再根据此中间片段分 别设计特异引物进行3’一cDNA末端快速扩增技术和5’一cDNA末端快速扩增技术分别扩 增到苹果脱氢抗坏血酸还原酶基因cDNA的3’端和5’端序列，最后获得基因cDNA全 长。序列包括的最大开放阅读框编码341个氨基酸;序列同源性分析表明苹果脱氢抗坏 血酸还原酶基因与烟草脱氢抗坏血酸还原酶基因、水稻脱氢抗坏血酸还原酶基因和番茄 脱氢抗坏血酸还原酶基因1/2的同源性分别为67%、27%、67%/96%。 3.将苹果脱氢抗坏血酸还原酶基因插入到表达载体PSBI “的多克隆位点中，构建 了含有它的植物表达载体pSB一DHAR。 关键词 苹果;脱氢抗坏血酸还原酶;基因克隆;载体构建 CLONINGOFDHARcDNAFROM APPLEAND PLANTEXPRESSIONVECTORCONSTRUCTION ABSTRACT Ascobrateactsasna il11Por1aI1tnatioxidnat inbothenznyIaticnadnon一enzymatic reactionsinPlnatcells.Formaintennaceofthenatioxidativeactiviytofascorbate，its regenerationisnecessary.Ascobrateisconcomitnatlyoxidizedtomonodehydroascobrate. Somemonodehydroascorbateradicalsarere一reducedniareactioncatalyzedbymonodehy- droascobratereductase，buttheremalnderul1dergoessPontnaeousdismutationtoascobrate naddehydroascorbate.DehydroascobratereductasecaatIyzesthere一reductionofDHAto ascobratebygluthatione二1飞ltls，dehydroascobratereductaseiscriticalofrProtectionof cellulracon1Ponentsagainstoxidativeinjury. InthisPpaer，werePortacDNAencodingthe paPIeDHARofrwhichwe hvae c0nsUrtctedaPlnatexPressionvector.ThisishtefirstrePortoftheD1lARcDNArofmurfit Tree.ItwouldbehelPuflaboutrnasferringthisgene.Sothatwecnagetmoreilllbmration abouttheroleDHARPlaysinAsA一GSHcyclenaditsmebatolism