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苹果多酚氧化酶双链RNA干扰 (dsRNAi)研究 摘 要 RNAi是最近几年才发展起来的研究生物体基因表达调控与功能的一项崭新的叁 因沉默技术，是由小千扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)引起的生物细胞内 同源基因的特异性沉默(silencing)现象，其本质是 “RNA与对应的mRNA特异结合、 降解，从而阻止mRNA的翻译。 以成熟苹果果实的RNA为模板，经RT-PCR扩增并克隆苹果多酚氧化酶 (APPO) 长度为710bp的反义、正义基因片段.以副球菌中类胡罗 卜素合成有关的(crtw+crty) 融合塞因片段YYT为间隔区，将APPO反义基因片段、YYT和APPt，正义基因片段串联， 将构成的全长为2444bp的。NA插入植物双元载体衅PX145，构成可表达苹果多酚氧化 酶双链RNA的植物双元载体pYF7704,该载体外源基因表达单元的两端含两个烟草核 基质结合区(SAR)序列，利于转基因的稳定遗传. 通过研究影响苹果离体叶片再生频率的内、外因子确立了长富2号苹果离体叶片 高效、稳定的再生体系，取继代培养28一35d试管苗的第3一5节位的处于生理活性 期的叶片，前期暗培养20d,培养基采用GMS:N量保持不变，以(NH,),SO。代替NH,N0, 并附加300mg/L的CH,激素种类、浓度及其配比如下，GMS+TDZ2.Omg/L+NAAO.6mg/L +CH300mg/L，再生频率达95%以上。 在遗传转化体系中，利用分步筛选的方法，在选一培养基GMS+TDZ2mg/L十 NAAO.6mg/L+CH300mg/L+Km12.5mg/L+Cb100mg/L，在选二培养基 GMS+BA2mg/L+ NAAO.2mg/L+CH300mg/L十Km25mg/L+Cb50mg/L，在选二培养基中降低激素、杀菌杭 生素含量和提高Km含量，有利于转化子的获得.通过分析影响遗传转化效率的因素， 确立高效遗传转化体系，浸染时间5min，共培养时间3d，共培养培养基中去除 Cocl,·6H20，卡那霉素选择压为12.5一25mg/L, 以根癌农杆菌介导的叶盘转化法转化长富2号苹果，通过25mg/L卡那霉素筛选 和GUS检测，获得了转基因植株.通过RT-PCR检测间隔区序列和内源多酚氧化酶证 明目的基因已经整合到苹果基因组中，并且有一定的干扰效果，通过笑光定量RT-PCR 检测，结果显示转基因苹果植株内多酚氧化酶基因的干扰效果达91.69%以上，研究结 果证实多酚氧化酶双链RNA干扰在转基因苹果上是可行的. 关键词:双链RNAi;PPO基因;载体构建;遗传转化;苹果;荧光定量RT-PCR RESEARCHONAPPLEPOLYPHENOLOXIDASE DOUBLE-STRANDEDRNA(RNAI) ABSTRACT RNAinterferenceisaformofpost-transcriptionalgenesilencing(PTGS)mediatedby double-strandedRNA(dsRNA).Itisanewdevelopedgene-silencingtechniqueusedinstudyinggene expressionregulationandfunction. Antisenseandsensegenerfagments(710basepairs)ofapplepolyphenoloxidase (APPO)genewereobtainedbyRTPCRamplification,usingthetotalRNAsisolated rfomripenapplefruitasthetemplate.Thesetworfagmentswereligatedbya1000bp spacer,YYT(crtW+crtYfusion)generfagment,whichisrelativetocarotenoid synthesizationinsubcocci.Thefull-length2444bp-targetgenewastheninsertedinto plantbinaryvectorpYPX145togeneratetherecombinantplasmidpYF7704,which carriedtheexpress