利用噬菌体展示技术制备全人抗DR5+scFv抗体.pdfVIP

Preparation of Anti-Human DR5 Single Chain Variable Fragment Antibody by Phage Surface Display Technique A Dissertation Submitted to the Graduate School of Henan University in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Medicine By Yingli Han Supervisor: A.P. Yuanfang Ma Fengtao Liu May, 2013 IV 摘 要 背 景 DR5是肿瘤坏死因子TNF相关的凋亡诱导的配体 （TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL ）的一个受体，通过它，TRAIL能诱导细胞发生 凋亡。本实验室利用DR5抗原制备出能分泌抗DR5的杂交瘤细胞。该抗体为鼠单克隆抗体， 但存在一些不足之处，妨限制了其在临床上的应用。随着基因工程技术的发展，利用基 因工程技术制备出全人抗体，不仅克服了鼠源性的弊端，鼠单抗特异性强、均一性强的 优点也被保留了下来。其中，全人抗体和人源化抗体的制备技术包括了以下三个方面： 嵌合抗体、CDR移植的抗体和展示技术与转基因技术制备的抗体，其中以噬菌体展示技 术可以制备全人抗体，从根本上克服了HAMA （human anti-mouse antibody ）反应，因此， 噬菌体抗体库技术属于最理想的制备全人抗体人方式。 目 的 通过利用噬菌体展示技术来建立天然噬菌体抗体库，并从中筛选、制备全 人源化抗体。 方 法 应用RT-PCR技术从人外周血淋巴细胞中获取人抗体可变区基因VH 、VL， 用重叠延伸PCR技术把连接肽基因（Gly Ser）与VH和VL连接成单链抗体scFv，利用SfiI 4 3 和Not Ⅰ酶切位点，将scFV基因连接入表达载体pcantab-5E 中，电转化入大肠杆菌 E.coil X-Blue 中，利用噬菌体感染，建立初级噬菌体抗体库。利用菌液PCR来鉴定所建立噬菌 体抗体库的插入率，挑取阳性克隆送北京金唯智生物技术公司测序，并经 NCBI-Blast-Ig-Blast ，来鉴定噬菌体抗体库的多样性。利用固相筛选对所建立的初级噬 菌体抗体库进行四轮富集浓缩，通过ELISA筛选出抗DR5 的scFV段阳性克隆。 结 果 成功的构建了库容量为1.01×107的天然噬菌体抗体库，经测序比对后多 样性良好，并从中筛选出一株表达频率较高的克隆，和4株与抗TNF- α抗体高度同源的 克隆。 结 论 成功的筛选出多株全人抗DR5抗体scFv，为抗体蛋白的获得打下了良好地 基础。并建立起了一个天然全人抗体库的技术平台，为以后筛选针对各种毒素、病毒、 I 病原菌等的相关抗原的抗体和获得特异性人源化抗体类药物奠定了基础。 关键词：噬菌体展示技术，天然噬菌体抗体库，全人抗体，DR5 II ABSTRACT Backgrand DR5 is one of tumor necrosis factor (TNF)-