ETEC+K88细胞适配体的筛选与快速检测分析.pdfVIP

分类号 密级 学校代码 10542 学号 201202141177 ETEC K88细胞适配体的筛选和快速检测 研究 The selectionand detectionresearchof rapid ETECK88 cell—aptameragainst 湖南师范大学学位评定委员会办公室 二零一五年五月 万方数据 摘要 大肠杆菌(E coli)引起的腹泻在世界范围内成为了一个主要的 公共卫生问题。其中产肠毒素大肠杆菌K88 Escherichia coli，ETECK88)是一种最常见的引起腹泻的致病菌。它 易于通过食物摄取进入体内，极易使新生儿和断奶仔猪的胃肠道发生 感染。因此，建立一种新的快速灵敏检测ETECK88的方法是非常必 要的。 和力和高特异性的结合。目前适配体常用的筛选手段为指数级富集配 体的系统进化技术(SELEX)。其靶标包括金属离子、有机小分子、 药物、甚至单分子蛋白质和细胞。与传统的抗体相比，它具有廉价、 易合成和可修饰的优点，被广泛的应用于分子检测、诊断治疗和生物 标记物发现等领域。 石墨烯具有独特的平面结构和优良的导电、导热性。氧化石墨烯 (GO)是一种富氧基团(c／o=2)的石墨烯，与石墨烯相比它极大的 增强了亲和性及水溶性。同时，作为一种高效的荧光淬灭剂，它能够 淬灭荧光体(上转换纳米材料、量子点及染料分子)的荧光，能稳定 的吸附ssDNA。近年来，利用GO优良的特性，相继开发了各种纳米 生物传感器。 本论文以ETECK88为目标细菌，通过SELEX方法筛选出细胞 适配体，并测定适配体与靶标之间的亲和力和特异性；构建了以细胞 万方数据 适配体为特异性探针，以GO为荧光淬灭剂的纳米生物传感器用于 ETEC K88的快速检测。具体实验结果如下： 一、采用CELL．SELEX技术，通过11轮正筛选和4轮反筛选， 获得了一组富集度高、特异性强的适配体序列。经纯化和克隆，得到 37个阳性克隆子。测序后进行一级同源性比对和二级结构分析，可 nm01)。 将它们分成三个家族。其中适配体A04的亲和力最高(K=28 后续实验表明，ETECK88与适配体A04的结合具有高特异性和灵敏 性。 二、利用GO纳米荧光淬灭剂的特性以及Klenow fragment(KF) -辅助靶标循环放大的功能，构建了一种新型的纳米传感器用于ETEC K88的快速检测。该传感器包括捕获探针和信号探针。靶标加入前两 个探针形成了部分双链结构(PDSJ)并且吸附在石墨烯上，此时荧 光淬灭。当加入靶标后，靶标与PDSJ形成了复合物，从而使PDSJ 从GO上释放出来，荧光得以恢复。随后KF的加入引发了PDSJ的 聚合反应，从而置换出靶标，置换出来的靶标能够与其它的PDSJ结 合，进入下一轮循环。靶标的循环利用使更多的PDSJ得以释放，检 测的荧光信号显著加强。实验结果表明，在菌体浓度102～108 CFU·mL’1范围内，该传感器具有高特异性和灵敏性，线性关系良好， 相关系数R2=0．9907。