产纤维素酶菌种的筛选与优化.docVIP

目 录 实验一 产纤维素酶菌种的分离与初筛 实验二 产纤维素酶菌种的复筛与保藏 实验三 酶活测定与传代保藏 实验四 产纤维素酶菌种的紫外诱变育种 实验五 产纤维素酶菌种的产酶条件优化 实验六 产纤维素酶菌种的产酶条件优化的结果分析 实验一 产纤维素酶菌种的分离与 一、实验目的 1．了解分离的； 2．掌握的操作方法。 二、实验原理β-D-glucanase,EC3.3.1.4,简称EBG），也称Cx酶、CMC酶、EG。这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维素； 外切型葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase,EC3.2.1.91），也称C1酶、微晶纤维素酶、纤维二糖水解酶（Cellobiohydrolase,简称CBH）,这类酶从纤维素长链的非还原性末端水解β-1,4-糖苷键，每次切下纤维二糖分子； Β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.21，简称BG）又称纤维二糖酶，它能水解纤维二糖以及短链的纤维寡糖生产葡萄糖，对纤维二糖和纤维三糖的水解很快。随着葡萄糖聚合酶的增加水解速度下降，这种酶的专一性比较差。 只有三种酶的协同作用，才能较好的分解纤维素。就单菌落而言，霉菌如木霉、曲霉和青霉的总体酶活性较高，产量大，故在畜牧业和饲料工业中的应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。 本实验以羟甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基作为筛选培养基，只有能够水解纤维素成单糖并加以利用的微生物才能在筛选培养基上生长，利用筛选培养基分离产纤维素酶的微生物。 以羧甲基纤维素钠（CMC-Na）为唯一碳源，通过微生物分解利用CMC-Na，分离出能产纤维素酶的菌种； 刚果红是一种酸性染料，可与纤维素反应形成红色复合物。 三、实验仪器及试剂 四、实验步骤 实验二 产纤维素酶菌种的筛与保藏 一、实验目的 1．； 2．掌握。 二、实验原理 通过酶活测定确定初筛菌株的产酶性能；通过培养条件的控制而菌种休眠实现保藏。 三、实验仪器及试剂 四、实验步骤 实验三 酶活测定与传代保藏 一、实验目的 1了解纤维素酶总酶活测定； 3．学习传代保藏的操作方法。 二、实验原理酶活的定义：在37oC PH5.5的条件下60min水浴，每分钟释放出1umol的单糖为一个酶活单位 三、实验仪器及试剂 2．仪器试管、烧杯、电磁炉、电子称、量筒、培养皿、酒精灯、移液枪、接种环、旋转式摇床等； ．试剂：柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、DNS等 四、实验步骤 葡萄糖 标准溶液/ml 蒸馏水/ml DNS/ml OD540nm 0 0 1 2.0 1 0.1 0.9 2.0 2 0.2 0.8 2.0 3 0.3 0.7 2.0 4 0.4 0.6 2.0 5 0.5 0.5 2.0 6 0.6 0.4 2.0 7 0.7 0.3 2.0 8 0.8 0.2 2.0 B．显色反应：在上述试管中分别加入DNS试剂2.0ml，于沸水浴中加热5min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0ml，摇匀，在540nm波长处测定吸光值。以葡萄糖含量（mg/ml）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 （2）滤纸酶活性（FPA）测定 取干净的10ml刻度试管若干，各加入0.5ml稀释10倍的粗酶液和0.5ml0.05mol/L，PH5.0的柠檬酸缓冲液，向对照管中加入0.5mlDNS溶液终止反应。将试管先在50℃水浴中预热10min，在各加入滤纸条50mg，50℃水浴中保温60min后取出，立即向上述试管中分别加入DNS试剂2.0ml，于沸水浴中加热5min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0ml，摇匀，在540nm波长处测定吸光值。 以上酶活测定时间均扣除发酵液中的还原糖后计算，采用国际单位即在上述条件下1min产生1umol葡萄糖为一个活力单位（IU/ml）。 2.菌种传代保藏 将菌种接种到在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2-8℃的冰箱保藏。保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2-4个月，移种一次。 此法为实验室和工厂军追踪室常用的保藏方法，优点是操作简便，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理。化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状，污染杂菌的机会也会较多。 实验四 产纤维素酶菌种的紫外诱变育种 一、实验目的 1．了解紫外诱变育种的原理； 2．掌握紫外诱变育种的操作方法。 二、实验