第章基因诊断与基因治疗精品.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * （3）基因直接注射技术 不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。 动物实验表明：接受注射外源DNA的小鼠能够按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。 将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%～40%； 将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素； 肌内注射凝血因子Ⅸ基因，可产生血友病所需的凝血因子Ⅸ 。 基因直接注射法的优点 制备具有调控部件的质粒DNA重组体的技术较容易； 排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用； 导入的基因不需整合即可表达，避免了反转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点； 基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。 三、基因干预 （gene interference） （一）反义RNA（antisense RNA） 1. 反义RNA与基因表达调控 利用反义RNA对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的方法有两种： （1）体外合成反义RNA，直接作用于培养细胞，细胞吸收RNA后，发挥作用。 （2）构建一些能转录反义RNA的重组质粒，将这些质粒转入细胞中，转录出反义RNA而发挥作用。 反义RNA的关键技术问题 ?反义RNA进入靶细胞前的降解问题 ?专一性转移问题 2.受体介导反义RNA转移技术 ①受体介导的RNA转移十分专一，而且效率高； ②被转移的RNA是被保护的，与周围环境之间存在多聚赖氨酸的保护层, 可以抵抗环境中的核酸酶的降解作用。 借助前述的受体介导基因转移方法，可以实现受体介导的反义RNA转移。 3. 反义RNA的优点 受体介导的反义RNA基因治疗有其自身的优点，而在一定程度上补充了转基因治疗的不足。 （l）安全性高 （2）反义RNA设计和制备方便 （3）具有剂量调节效应 （4）能直接作用于一些RNA病毒 （二）核酶 (ribozyme) 天然核酶多为单一的RNA分子，具有自我剪切作用。但核酶也可以由两个RNA分子组成。 在基因治疗时，利用核酶分子结合到靶RNA分子中适当的部位，形成锤头状核酶结构，将靶RNA分子切断，通过破坏靶RNA分子而达到治疗疾病的目的。 核酶锤头状的二级、三级结构 只要两个RNA分子通过互补序列相结合，形成锤头状的二级结构（3个螺旋区），并能组成核酶的核心序列（13个或11个保守核苷酸序列），就可在锤头右上方产生剪切反应。 目 录 1.核酶的设计 核酶是通过靶RNA分子与核酶分子共同组成酶活性结构域，要从靶分子和核酶分子两个方面来设计核酶。 （1）选择合适的靶部位，该部位具有核酶切割位点，能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。 （2）核酶的基本组成：用于基因治疗的核酶分子由三个部分组成，中间是保守序列（能够组成酶活性结构域），两端是引导序列。 核酶的作用机制 2.核酶的应用 与一般的反义RNA相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击。更重要的是，核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它的mRNA分子。 （三）干扰RNA 1.RNA干扰现象 RNA干扰（RNA interference， RNAi）是一种由双链RNA诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，从而抑制该基因的表达。有义RNA（sense RNA）或反义RNA（antisense RNA）均能抑制线虫基因的表达，双链RNA比单链RNA更为有效。这与传统上对反义RNA技术的解释正好相反。而且其抑制基因表达的效率比反义RNA至少高2个数量级。 2.RNA干扰的机制 RNA干扰过程主要有2个步骤： （1）小干扰性RNA（siRNA） （2）siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体