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Novagen公司的大肠杆菌菌株选择 3. 二硫键形成与溶解性增强 二硫键的形成对某些蛋白的可溶性起到重要的作用，而Novagen也专门设计了一些菌株是谷胱甘肽还原酶（gor）和/或硫氧还蛋白还原酶（trxB）缺陷型的，包括AD494，BL21trxB， Origami，Origami B和Rosetta-gami?。在这些菌株中表达蛋白，可以更大程度促进二硫键的形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出现的可能增加。 4. 稀有密码子的补给 不同物种有不同的密码子偏爱性，如果外源蛋白中含大量大肠杆菌的稀有密码子，特别当这些稀有密码子呈连续分布的时候，就会造成蛋白表达量极低，或者翻译提前终止。Rosetta?是为了表达真核蛋白而特别设计的，它含有大肠杆菌稀有的密码子tRNA，包括AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA。它们以氯霉素抗性的质粒形式存在。Rosetta系列是来自BL21lacY1，所以它具有BL21lacY1的所有特性。 5. 硒蛋氨酸标记 B834是来源于BL21的蛋氨酸（met）营养缺陷型菌株。它在高度特异活性35S-met标记和晶体成像蛋氨酸标记中非常有用。 原核表达需要考虑的问题 在原核蛋白表达过程中，选择构建一个合适原核表达体系需要综合考虑3大因素：表达载体、宿主菌株、表达诱导条件,以获得最满意的表达效果。 大肠杆菌表达系统的高效表达策略 1、采用高强度启动子-如T7启动子； 2、将目的基因所有密码子都换成大肠杆菌 偏好的密码子（需要重新合成基因）， 或采用含有大肠杆菌稀有密码子tRNA 的Rosetta系列菌株。 3、采用丰富培养基（如TB）代替普通的LB培养 基； 4、优化大肠杆菌的生长条件和目的基因的诱导表 达条件。 使用pET表达系统的常见问题分析 几个常见问题如下表： 原核表达常见的几个问题及回答（1） 1、目的蛋白总是以不可溶的形式出现。 解决办法：采用以下八种策略提高目的蛋白的可溶性。 提高大肠杆菌表达系统重组蛋白可溶性的策略 大致有八种策略： （1）在细胞中表达分子伴侣（天然或异源），辅助新生肽链折叠，避免 肽链相互聚合； （2）共表达折叠酶，催化共价键形成； （3）通过降低培养温度和摇床速度来降低蛋白合成速度，以降低有聚 合倾向的中间体的浓度； （4）选择中等强度或低强度的启动子代替强启动子，降低重组蛋白的合 成速度； （5）选择适合的宿主菌株； （6）表达含可溶性多肽或信号肽的重组蛋白，提高可溶性； （7）蛋白质的可溶性往往与自身的氨基酸序列有关，因此可利用诱突 技术改变其氨基酸序列，提高目的蛋白的可溶性； （8）诱导过程中加入化学物质，以增加渗透压或改变培养基的pH值。 原核表达常见的几个问题及回答（2） 2、必须去除融合多肽或蛋白质标签才能使目的蛋白获得活性吗？ 回答：大多数情况下目的蛋白带有His- Tag,S-Tag,11个氨基酸的T7-Tag或HSV-Tag等小肽时仍能表现出完全的活性。这些肽段都较为亲水，理论上都不会干扰蛋白的三维结构。我们建议首先测试蛋白活性，再看是否一定要去除前导序列才能适合特定的应用要求。 原核表达常见的几个问题及回答（3） 3、如果目的蛋白包含信号序列，它会不会被运至细胞周质并以可溶、活性形式存在？还是目的蛋白甚至可以被分泌到生长培养基中？ 回答：如果目的蛋白包含ompT或pelB这样的前导序列，理论上它应该被运至细胞周质并以可溶、活性形式存在。如果在生长培养基中发现目的蛋白的话，多半是因为细胞壁受到破坏，而并不代表蛋白是被分泌到培养基中的。除了信号肽对蛋白质的运输有影响，现在发现蛋白质的成熟区对蛋白质的运转也有影响。因此在细胞质、细胞周质及其它区域发现目的蛋白都很正常。某些情况下降低诱导时的培养温度至25-30 ℃，可能提高蛋白运输的比例。 原核表达常见的几个问题及回答（4） 4、IPTG诱导后细胞停止了生长，是不是表示细胞死了？ 回答：T7RNA聚合酶非常活跃，T7转录和翻译信号极强，因此，一旦诱导，细胞的主要生理活动都向着目的蛋白表达的方面转化。在通常情况下，细胞将停止生长，形成克隆的能力大大降低，但并未死亡。菌落形成试验可以用来检测表达系统的性能。但也有一些例外情况，例如特别的目的基因以及一些极为严紧的载体/宿主菌组合(比如含有plysE的宿主菌)等，这时在诱导后菌落还是会继续生长。 原核表达常见的几个问题及回答（5） 5、除了毒性和降解，还有些什么因素会影响目的蛋白的表达水平？ 回答： （1）mRNA转录子中的二级结构会干扰AUG翻译起始密码子和/或核糖体结合位点。所有pET载体的转录产物都是下