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shRNA表达载体抗猪传染性胃肠炎病毒感染的研究 摘要 TransmissibleGastroenteritis 猪传染性胃肠炎病毒(Porcine Transmissible 道疾病，常在冬春季节呈暴发性流行，病猪以呕吐、水样腹泻、严重脱水 为临床特征。不同年龄和品种的猪对本病均易感，其中两周龄以内的仔猪 死亡率可达100％，死亡原因通常为脱水和电解质紊乱。随着年龄的增大， 死亡率会逐渐下降，但是耐过猪生长发育迟缓，饲料报酬率降低。本病发 病迅速，危害严重，波及范围广，呈世界范围分布，大多数养猪国家都有 本病发生，给世界养猪业造成巨大的经济损失。我国自从50年代首次报道 TGE以来，部分地区仍有该病发生和流行，甚至在局部地区暴发。 针对TGE，常规药物没有明显治疗效果，目前常用的治疗措施是疫苗 接种。但是广泛使用的常规疫苗本身存在着各种各样的缺陷：灭活苗制作 成本高而保护能力低；弱毒苗存在散毒和返强的危险，而且干扰田间野毒 感染的诊断；而作为替代的基因工程疫苗、核酸疫苗等因生产成本及免疫 保护能力等问题大多尚处于实验室阶段，还有较长的一段路要走。所有这 些均成为有效防治TGE、发展养猪业的瓶颈。继续研制新型、安全和更有 第1页 效的TGEV疫苗或其他防治措施为必然之势。 RNAi是生物体自身固有的抵御外来感染的机制。它通过严格的基因序 经远远超过了传统的反义基因调控技术，一跃成为哺乳动物体外和体内科 学研究的强大工具，在抗癌症、抗病毒感染方面显示出巨大发展潜力。许 多疑难疾病和大量已知序列的动植物病毒已经在基因水平被很好抑制。本 病病原TGEV，病原学分类明确，一般生物学特性以及基因组结构、功能 等研究较为透彻，并且是单股正链RNA病毒，本身即可行使mRNA功能。 所以，运用RNAi技术抗TGEV感染有着很好的技术背景和生物学基础。 综上，本研究考虑运用特异高效、技术日趋成熟而成本日益下降的 治手段作一有益探索；并希望通过小型猪体内RNAi抗TGEV的试验研究， 为临床研制抗病毒制剂做准备，并为大型动物体内RNAi及相关肠道病毒性 疾病的RNAi提供参考资料。 本研究共分以下三个部分： 第一部分(第二章)： 首先，通过对TGEs．1基因易突变区(S基因5’端)设计跨突变区引物， 成功扩增了国内分离株TGEs．1的S基因5’端序列，包括小部分聚合酶基 因序列。把测序结果与GenBank中TGEVSC．Y分离株同源序列比对，结 S基因5’端所测序列与国内己发表 果显示同源性为98％。接着，把TGEs．1 第1I页 ABSTRACT 的TGEVSC．Y基因组其他部分较为保守的序列相结合，利用相关设计软件 基因的shRNA表达载体：pEGFP—U6／P 1、 pEGFP—U6／$2、pEGFP—U6／M、pEGFP—U6／N 有效而稳定地干扰TGEs．1的复制打下了基础。 第二部分(第三章) TGEV病变一般从孔边缘开始向孔中部漫延)，而其他各干扰孔均出现了 1对 表达载体pEGFP．U6／P 1矛I]pEGFP—U6／N 1、pEGFP．U6／P2、pEGFP—U6／S 第1IJ页 变效应是源自序列特异的RNAi作用。综合以上结果，我们初步筛选出 shRNA表达载体。 第三部分(第四章) 采集肝、肺、肾、空肠、回肠、盲肠、脾和肠系膜淋巴结。每个样品分三 份，分别用于制作石蜡切片、冰冻切片和RT-PCR检测。在攻毒26小时后， 只攻毒猪就开始拉黄色稀便，站立不稳，脱水、消瘦。这种情况一直持续 到采样，而其他猪表观正常，食欲旺盛。病理切片分析结果显示，部分