RNA干扰及治性DNA疫苗抗乙型肝炎病毒研究.pdf

RNA 干扰及治疗性 DNA 疫苗抗乙型肝炎病毒研究 摘 要 病毒性乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染 引起的一种严重危害人类健康的传染病。目前通常采用干扰素、核苷 类似物和其它免疫调节剂等进行乙型肝炎的治疗。但由于乙肝病毒能 以共价闭合环状DNA （cccDNA ）的形式存在于肝细胞核内，而抗病 毒治疗容易引起病毒的耐药性突变及其他的副作用，因此亟需发展新 的有效的治疗药物和方法。RNA 干扰现象的发现为病毒性乙型肝炎 的有效治疗提供了一条新的思路。 RNA 干扰（RNA interference ）是一种由双链 RNA 诱发降解同 源 mRNA 的基因沉默（gene silencing ）现象。该作用除了具有高度 的特异性、高效性外，人们还可以针对病毒基因保守区域选择多个靶 点进行 RNAi 治疗, 以应对病毒变异产生逃避突变株，更重要的是 RNAi 在病毒非活跃复制期也能发挥作用。 基于 RNAi 技术的众多优点，我们对应用 RNAi 进行抗乙肝病毒 治疗的效果进行了研究，从 RNAi 靶序列的选择，siRNA 的载体制备， 它们在细胞模型和动物体内的抑制乙肝病毒基因表达的效果，及其剂 量效应，时间效应和作用稳定性等方面进行了考察，希望为发展RNAi 抗乙肝病毒药物提供参考。 进一步地，我们还针对 siRNA 作为抗病毒药物应用的一个瓶颈 问题：siRNA 的输送和细胞转染效率，进行了研究。对提高质粒 DNA 的细胞转染和肝靶向输送进行了多种尝试，获得了有潜在应用价值的 一些前期结果。虽然 siRNA 的体内输送和转染依然是限制 RNAi 相 关药物研发的关键问题，希望我们的这些尝试能为最终的解决方案提 供一些思路。 最后，我们也对乙肝治疗新方案中的另一条重要思路：乙肝治疗 性 DNA 疫苗的药效进行了研究。我们实验室在前期工作中，发展了 DNA 疫苗的电导入技术，免疫健康小鼠和恒河猴模型后，产生了快 速和强烈的体液和细胞免疫。在本论文工作中，我们进一步地验证了 产生的免疫应答对病毒蛋白的清除作用，我们分别使用模拟乙肝病毒 感染的小鼠（尾静脉高压注射乙肝表面蛋白表达质粒）和感染乙肝病 毒的狒狒（baboon ）作为动物模型，观察电导入DNA 疫苗后诱导的 免疫应答情况及对乙肝病毒的清除情况，为治疗性疫苗的临床研究提 供了重要的支持。 本论文的主要内容及结果总结如下： 1．我们根据国内乙肝病毒流行的情况和实验模型确定了研究用 乙肝病毒的亚型并通过测序确定了基因序列，根据 RNAi 干扰作用的 特点在乙肝病毒复制转录和分泌过程中发挥重要作用的表面蛋白编 II 码区－S 区选择了三段序列作为 RNAi 作用靶点，经 BLAST 验证与 其它基因无明显同源性后针对这三个靶点用化学合成法制备了 siRNA 和化学修饰（其中对 A,U 碱基甲基化修饰）的 siRNA，同时 我们也设计了用于 siRNA 表达载体构建的 DNA 插入片段，并将其克 隆到带人 U6 启动子的 shRNA 质粒表达载体上，经酶切及测序验证 后大提纯化以用于细胞及动物实验。 2 ．我们用细胞模型研究了 siRNA 对 HBV 抗原基因复制和表达 的影响。我们首先将 siRNA、甲基化修饰 siRNA 或 shRNA 表达质粒 与乙型肝炎病毒表面抗原真核表达质粒(pHBS)共转染 HuH-7 细胞， 结果表明针对 S 区基因筛选和合成的 siRNA 都能在肝细胞中明显降 解靶基因 mRNA ，减少表面抗原的形成（抑制率达到 80－90 ％），同 时它们的作用随着剂量的增加而加强，针对三个靶点的 siRNA 同时 使用也可以一定程度上增强对表面抗原合成的抑制作用。不过三种形 态的 siRNA 的作用和动力学特征有所不同，其中 siRNA 作用较强但 作用维持时间较短；甲基化修饰一定程度上影响了 siRNA 的干扰作 用，但另一方面也增加了 siRNA 的稳定性，延长了干扰作用的时间； 而 shRNA 表达质粒的作用与 siRNA 相似，但它的作用时间明显比