滚环扩增技术在na甲基化检测芯片及高通量dna测序技术中的应用研究.pdf

中文摘要 中文摘要 论文题目：滚环扩增技术在DNA甲基化检测芯片及高通量DNA测序技术中的应用研 究 博士研究生：赵洪 导师姓名：陆祖宏教授 学校名称：东南大学 DNA芯片是通过将大量不同的DNA靶分子按照已知顺序固定在固相基片(多数 circle 靶核酸进行检测分析。滚环扩增技术(Rolling 增技术，在DNA、RNA、SNP、细胞原位检测、全基因组扩增方面有较多的应用。异 常的DNA甲基化与癌症及许多其他疾病的发生密切相关，发展高通量和高特异性的 DNA甲基化检测芯片具有重要的临床应用价值。本论文以滚环扩增技术为主，发展了 多种基因组DNA甲基化检测的新的DNA芯片检测方法。本论文还针对新一代DNA测 序技术中的高密度DNA文库制备问题，采用滚环扩增技术和在片原位链替代方法获得 了可用于测序的基因组片段芯片。还进一步地把高密度磁珠微阵列技术和微流体芯片技 术相结合，发展了一种高密度磁珠的微流体DNA测序芯片。 具体内容包括： 1、基于分枝滚环扩增(HRCA)技术的特定CpG位点的甲基化检测芯片 针对包含酶切位点的特定CpG位点，提出并实现了一套新的基于分枝滚环扩增 原理的样本处理方案。设计一个锁式探针与目标DNA序列在CpG位点杂交，并通过甲 基化敏感性内切酶和连结酶对锁式探针与目标DNA同时进行酶切和连结。当CpG位点 处于甲基化状态，锁式探针能成功地被连接酶环化，成为HRCA反应的环状模板。连结 形成的环状模板与HRCA反应所需的两个引物杂交后启动HRCA扩增。将一个引物末 端进行丙烯酰胺修饰，可以使HRCA产物固定在丙烯酰胺基片上形成3．维胶基DNA微 阵列。通过与CY3标记的探针杂交，即可检测CpG位点的甲基化状态。利用这个方法， 状态进行分析。实验结果得到甲基化特异性PCR验证。研究表明，该方法快速便捷， 可用于高通量定性分析基因组DNA中特定CpG位点的甲基化。 2、基于滚环扩增(RCA)技术的CpG岛甲基化的定量检测芯片 为了识别目的基因中的甲基化和未甲基化的CpG位点，样品DNA首先用亚硫酸 氢盐处理。目标区域通过PCR扩增后，未甲基化的CpG二核苷转化成TpG；同时甲基 I I 东南大学博士论文 化的CpG得到保留。设计一对锁式探针，其中一条与CpG位点匹配，另一条与TpG匹 配。锁式探针对与纯化的PCR产物杂交，当锁式探针的两个末端与PCR产物匹配时， 锁式探针才能被连结，并形成RCA反应所需的环状模版。这样，通过我们设计的一对 锁式探针，把原目标基因中Cp6位点甲基化状态的信息用对应的环状模版所表述出来， 并在下一步的RCA反应中被放大。连结的锁式探针与RCA通用引物杂交后，在①29 列。DNA微阵列与通用的CY3．CY5双色探针对进行杂交。而这两种通用探针分别针对 甲基化和非甲基化而设计的，通过杂交产生的两种荧光强度的比值可以用来检测样本中 基化状态进行了定量分析，实验结果得到甲基化特异性PCR验证。实验结果表明，这 种RCA产物微阵列有望用于CpG岛的甲基化状态的定量分析。 3、利用滚环扩增和在片原位链替代扩增来平行展示基因组片段 高通量测序技术，要求在一个芯片大小的面积上，同时进行上百万个大规模平行 的测序反应以获得极高的测序通量。因此只有将上百万个待测基因组DNA片段平行地 展示于芯片，形成高密度的DNA测序芯片，才能满足这种高通量测序的要求。我们利 用029 DNA聚合酶进行两步扩增从而在玻片上产生大量的DNA克隆群落，这些克隆 群落可以实现基因组DNA片段在玻片上的平行展示。本研究中，在巾29DNA聚合酶 作用下，基因组DNA片段先以RCA的方式在液相中扩增，然后再以链替代反应的方式 在玻片上进一步扩增。利用这个方法产生的DNA克隆群落成功地实现了T7基因组片段 在玻片上的平行展示。这些DNA克隆群落可以成功地用杂交或荧光．dNTP进行识别， 被展示的DNA片段和背景荧光信号有明显的区别。本方案有较好的重现性，用本方案 产生的DNA克隆群落有望用于高通量测序。 4、利用微流体技术和磁珠阵列制作高密度测序芯片 通过磁珠乳液PCR可以制备出表面带大量DNA片段克隆的磁珠，这种克隆磁珠 已经成功用于制备高密度测