凡纳滨对虾体内蔽态T-2毒素的共性表征与危害识别.pdfVIP

凡纳滨对虾体内隐蔽态T-2 毒素的共性表征与危害识别 摘要 以T-2 毒素暴露未出现物质蓄积的染毒对虾各组织匀浆液进行小鼠灌胃。分析小 鼠的免疫功能指标、血清生化指标和遗传毒性指标的变化，根据总体概率学分析识别 染毒对虾对小鼠的损伤效应。结果显示，染毒对虾对小鼠的免疫功能和遗传特性产生 明显损害效应（出现P0. 05 的概率高），而小鼠的血清生化指标未出现明显变化（出 现P 0. 05 的概率低），表明染毒对虾具有免疫毒性和遗传毒性，对小鼠造成的肝毒 和肾毒损伤效应较小。染毒对虾自身没有T-2 毒素的物质蓄积却表现出对小鼠免疫和 遗传上的功能蓄积毒性，说明了染毒对虾中可能存在隐蔽态T-2 毒素，可通过对虾食 物链，对小鼠产生损害效应。 不同暴露剂量T-2 毒素口服20d 蓄积染毒对虾经有机溶剂提取，再采用三氟乙酸 水解法处理，通过LC-MS/MS 检测处理前后样品中T-2 毒素含量，结果证实了对虾 体内隐蔽态T-2 毒素的存在；明确了对虾中隐蔽态T-2 毒素主要集中在对虾的肝胰腺、 血液、肌肉、虾头中，且隐蔽态T-2 毒素解离率与对虾的暴露剂量呈正相关。肝胰腺 为最主要的隐蔽态存在部位，在肝胰腺的上清样中T-2 毒素的增量为约为23.6 ng/尾， 肝胰腺残渣样中解离出的T-2 毒素增量约为为11.0 ng/尾。残渣样中隐蔽态T-2 毒素 被解离出，表明有机溶剂分离提取对虾体内的隐蔽态T-2 毒素存在一定量的损失。 核磁共振和质谱表征，证明了目标T-2 毒素母核半抗原3-Ac-NEOS 的合成，利 用红细胞酶解法制备半抗原3-Ac-NEOS 的方法可行且纯度较高，半抗原的制备得到 优化，经柱色谱分离纯化后，得到半抗原合成率为 60%左右。在蒸气浴条件下， 3-Ac-NEOS 与琥珀酸酐 （HS ）反应合成了在C8 位具有连接臂的3-Ac-NEOS-HS ，后 通过碳二亚胺法将半抗原与载体蛋白偶联制备T-2 毒素母核完全抗原，采用紫外扫描 及SDS凝胶电泳，最终确定了半抗原3-Ac-NEOS 与蛋白的成功偶联，其中免 疫原 3-Ac-NEOS-HS-BSA 内 3-Ac-NEOS 与 BSA 的偶联比为 8.76 ：1，包被原 3-Ac-NEOS-HS-OVA 内3-Ac-NEOS 与OVA 的偶联比为7.24 ：1，两个都在范围(3~45) ： 1 之间，都具有免疫原性，且其中免疫原的偶联比为8.76：1 在范围(8~25) ：1 之间， 表明能够进行免疫产生具有较高效价的抗血清。 利用制备的T-2 毒素母核完全抗原免疫新西兰种兔子，经间接ELISA 法检测， 在第五次加强免疫后的抗血清，效价达到 1：64000，可用于纯化制备抗体。利用纯 化后的抗体建立间接竞争ELISA 法分析抗体的灵敏度和特异性，结果显示T-2 毒素 母核抗体相对于具有母核结构的 A 型单端孢霉烯族毒素特异性差，但相对于不具有 母核结构的B 族毒素DON 的特异性强，表明T-2 毒素母核抗体可识别隐蔽态T-2 毒 素。间接竞争ELISA 对T-2 毒素的检测限为49 ng/mL ，IC50 为0.228 µg/mL 。 I 同时利用包被抗原3-Ac-NEOS-HS-OVA 偶联羧基磁珠，制备了可识别T-2 毒素 母核抗体的 3-Ac-NEOS-HS-OVA-免疫磁珠 （T2-IMB ），并以此磁珠建立间接竞争 ELISA ，即免疫磁珠间接竞争ELISA （T2-IMB-ELISA ）。T2-IMB-ELISA 对T-2 毒素 母核的检测限为0.023 µmol/L，相当于10.7 ng/mL 的T-2 毒素，检测限明显低于建立 的常规间接竞争ELISA 法49 ng/mL 的检测限；对T-2 毒素加标检测的平均回收率为 92.37%，且变异系数均在变异系数在3.26~6.43 之间，说明T2-IMB-ELISA 具有较高 的回收率和检测准确性。T2-IMB-ELISA 被成功应用于检测对虾体内的隐蔽态T-2 毒 素，结果显示，以最高剂量组肝胰腺为例，检测到的隐蔽态 T-2 毒素为 0.057 nmol/ 尾。若全部解离为T-2 毒素的，可得到T-2 毒素的增量为26.7 ng/尾。结果高于用解 离法检测到的23.6 ng/尾增量。表明了解离法处理隐蔽态T-2 毒素不完全，有部分损 失。T2-IMB-ELISA