单增李斯特菌酶免疫吸附法的研究.pdfVIP

摘要 摘要 单增李斯特菌(Listeria monocytogens，LM)是一种重要的食源性致病菌， coli 它与E 0157、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌统称为最重要的四大食源性致 病菌。在LM的众多血清型中，4b型是出现最多，也是最能引起人类和牲畜患 病的血清型，该菌能引起人、畜的李斯特菌病，感染后的症状主要表现为败血 症和脑膜炎。本研究旨在建立一种免疫分析方法用于样品中LM(血清型4b)的 快速筛选。研究内容包括三个部分： (1)LM鞭毛的制备 本研究将在22℃和37。C培养的LM(血清型4b)通过超速离心法获得鞭毛，一 最终通过SDS．PAGE试验以及透射电镜加以证明。研究结果表明，22℃培养的 LM有大量鞭毛产生，而37℃没有或只有一根鞭毛产生；另外，经酸解超速离 心法获得的鞭毛浓度高(1．1 mg／mL)，纯度高，而且试验耗时短，适用于LM鞭毛 蛋白的提取。 (2)LM选择性培养方法的建立 本研究按FDA法进行增菌，在一定的体系内观察金黄色葡萄球菌、志贺氏 菌以及Ecoli0157等三种杂菌对LM的影响。研究结果表明，选择性培养基对 三种杂菌有一定的抑制作用；其中，BLEB(含吖啶黄素)对分离菌的抑制效果 最好，其次是BLEB(不含吖啶黄素)和TSB。 (3)LM双抗夹心ELISA方法的建立 用LM及其制备的LM鞭毛蛋白作为免疫原，得到兔抗LM多克隆抗体及 鼠抗LM鞭毛蛋白多克隆抗体，经10周5次免疫后，抗体效价可达106以上。 两种多抗经纯化后免疫血清的浓度分别为9．083mg／mL和7．940 mg／mL。建立了 LM双抗夹心间接ELISA检测方法，通过对包被液，包被时间、底物作用时间、 酶标二抗稀释倍数以及封闭液进行优化，从而确定了双抗夹心ELISA法检测 mol／L LM的最佳反应条件。研究结果表明，最佳反应条件分别为：包被液为O．05 9．6)，TMB底物显色时间为15min，羊抗鼠酶标二抗稀释 碳酸盐缓冲液(pH h。 倍数为5000倍，封闭液为1％BSA，包被条件为37℃，2 关键词：单增李斯特菌；鞭毛；选择性培养；酶联免疫吸附试验； ABSTRACT ABSTRACT Listeria oneofthemost foodborne monocytogenes(LM)is important pathogens， witlltheotherthree EcoliO1 and aureus．Inall 57，salmonella being Staphylococcus the ofListeria isthemostcomi／lonandcause serotypes monocytogenes，4b type adverse reactionsofhumanandanimal．The causedLMinclude majorsymptomsby and our hadbeen forthe Septic