腐败希瓦氏菌卵抗体抑菌作用方式的研究.pdfVIP

谨以此论文献给林洪教授以及我挚爱的家人和朋友 谨以此论文献给林洪教授以及我挚爱的家人和朋友 谨谨以以此此论论文文献献给给林林洪洪教教授授以以及及我我挚挚爱爱的的家家人人和和朋朋友友 ——张茜 ——张茜 ————张张茜茜 腐败希瓦氏菌卵黄抗体抑菌作用方式的研究 摘 要 卵黄抗体（IgY），是禽类血清中的 IgG 进入到卵黄中而形成的一类免疫球蛋 白，其性质稳定、提取便捷、特异性强、安全高效，作为功能性食品添加剂、食 品免疫检测材料及生物保鲜剂，在食品领域的应用范围逐渐扩大。腐败希瓦氏菌 卵黄抗体（IgY），是一种靶向性抑制水产品中常见腐败菌——腐败希瓦氏菌的免 疫球蛋白，目前研究已证明，腐败希瓦氏菌 IgY 在液体、固体培养基中均能抑制 腐败希瓦氏菌体的生长，并能较显著延长牙鲆鱼肉的货架期。目前，由于腐败希 瓦氏菌 IgY 的抑菌作用机理尚不明确，在 IgY 的实际推广中，存在使用浓度大， 作用时间有限等问题，使这种特异性 IgY 在水产品保鲜中的应用受到了一定的限 制，同时在寻求其抑菌增效因子时也存在盲目性。 本研究，主要以纯度较高的腐败希瓦氏菌 IgY 作为研究对象，研究它对抗原 菌生长形态以及各项生理指标的影响，以探究腐败希瓦氏菌 IgY 对抑制菌体生长 的作用方式，同时对 IgY 与菌体的作用位点进行了判定。随后，研究在抑菌作用 方式的基础上，通过蛋白酶酶解的方法对大分子的 IgY 进行处理，有针对性的寻 求一种提高 IgY 抑菌作用效果的方法。主要的研究结果如下： 1. 利用凝胶层析的方法，建立了一套有效纯化腐败希瓦氏菌IgY的层析方 法，回收率为89.60%，纯化后的IgY纯度达到92.33%，效价为1:1000以上，相比 未经纯化的IgY效价提高两倍以上。 2. 对腐败希瓦氏菌 IgY 对菌体的生长形态、生理指标进行了观察和测定， 结果发现经 IgY 作用后，菌体细胞发生破裂、扭曲，有些细菌细胞壁明显变薄。 细菌疏水性下降，细胞壁和细胞膜均发生破裂。菌体与 IgY 相互作用后的上清溶 液，经甘氨酸解离作用后，发现了一种大分子的特征组分。通过对该特征组分分 子量、单糖组成、红外光谱性质以及脂肪酸成分的测定，并结合核磁信号确定了 其大小为 58.3 万道尔顿，主要由 D-(+)-氨基葡萄糖、D-(+)-氨基半乳糖盐酸盐、 葡萄糖、D-半乳糖以及古洛糖醛酸构成多糖组分，并含有一定量的十二烷酸、十 四烷酸和十六烷酸，推测为菌体表面脂多糖成分。经过综合分析，提出 IgY 抑制 I 腐败希瓦氏菌生长的方式主要是通过靶向性与菌体表面脂多糖物质发生类似抗 原抗体结合的作用，然后通过静电等作用，改变菌体疏水性，阻碍脂多糖发挥保 护作用，从而逐渐造成菌体细胞壁松散和细胞膜的破裂，进而造成了菌体的死亡。 3. 在抑菌作用方式的基础上，提出保留 IgY 抗原结合部位，同时适当降低 IgY 分子量的方法以提高 IgY 抑菌作用效果。利用高效液相色谱法动态观测胃蛋 白酶对腐败希瓦氏菌 IgY 的作用，确定了胃蛋白酶法制备 IgY-Fab 的最佳条件为 pH=4.2 的醋酸缓冲液作用 6h，IgY：胃蛋白酶=20:1（质量比）。酶解混合液经 Sephacryl S-100 High Resolution 柱层析分离纯化后，即得 43kD 的活性片段，纯 度大于 90%。该活性片段保留了大部分的抗原结合和抑菌能力，在对冷藏大菱鲆 鱼肉的保鲜效果中显示了优于等摩尔浓度 IgY 的效果。 本研究填补了目前卵黄抗体对腐败希瓦氏菌作用方式的研究空白，有针对性 的提出提高 IgY 抑菌效果的方案，为今后腐败希瓦氏菌 IgY 及其他相似 IgY 在 食品保鲜领域的推广应用奠定理论基础，并提供了一种新的提高生物保鲜物质抑 菌作用的思路。 关键词：腐败希瓦氏菌卵黄抗体；纯化；抑菌机制；酶解片段 II The Inhibitory Effect of Egg yolk Immuno