应用多肽毒素探针的研究离子通道的结构和功能.pdf

IllIlI rIIIJllullillM llllJfillIIj 中文摘要 专一性作用于电压门控钠离子通道的天然多肽毒素可作为研究通 道结构与功能关系的分子探针。本研究从雷氏大疣蛛和敬钊缨毛蛛 毒液中分别鉴定到了两个新的小分子多肽：作用于钠通道亚型 肽毒素作为分子探针，我们分别对Na，1．3通道晚期钠电流的形成机 制以及细菌钠通道上的保守神经毒素作用位点作了深入的探讨。 在本文的第二章，我们利用RTX-VII作为分子探针研究了Na，1．3 通道的四个结构域在晚期钠电流产生中的作用。RTX-VII是一个35 为4072．68 的连接模式形成四对二硫键。对各哺乳动物钠通道亚型进行活性分 诱导通道产生大的晚期钠电流。但高浓度RTX—VII对Na，1．4，Na，1．5， Na，1．7通道和DRGTTX—R钠通道的电流都没有影响。提示RTX—Vll 具有较好的钠通道亚型选择性。RTX-VII浓度依赖性的诱导Na，1．3 nM。毒素结合到 通道的晚期钠电流，其半数有效浓度(EC。。)约为120 Na，1．3通道和毒素从Na，1．3通道上的洗脱都较慢，其结合时间常数 S。 和洗脱时间常数分别为40．9±11．3S和162．8±39．7 强去极化电压下不影响通道的峰电流。毒素处理后Na，1．3通道的峰 电流和晚期钠电流具有相同的激活动力学。RTX—VII使Na，1．3通道 的激活动力学向超极化方向漂移，对通道失活的电压依赖性不产生 影响，但毒素在失活曲线上诱导了一个稳态成分。与许多Alpha蝎 毒类似，RTX-VII与Na，1．3通道相互作用表现出电压依赖性的解离 和重新结合。RTX-VII从Na，1．3通道上解离具有电压和时间依赖性， 而毒素重新结合到Na，1．3通道上只具有时间依赖性。毒素基本不影 响NaA．3通道的失活后恢复动力学。 RTX—VII抑制海马神经元钠通道的失活提示毒素可能引起中枢神 经系统超兴奋，小鼠侧脑室注射毒素证实了这一假设。随后我们以 Na，1．3通道和海马神经元钠通道作为模型研究了RTX—VII引起小鼠 中枢神经系统兴奋性中毒的原因。RTX-VII激活了Na，1．3通道在不 同速率的斜坡电压下的电流，并导致斜坡电流第一个峰向超极化方 万方数据 向漂移。同时，我们的研究发现RTX—VII同步增强Na，1．3通道的晚 期钠电流和斜坡电流的第二个峰，这两种电流成分存在紧密的线性 的斜坡电流产生了与对Na，1．3通道的斜坡电流类似的影响，包括增 强斜坡电流的幅度以及诱导斜坡电流的第一个峰向超极化方向显著 的漂移。在毒素诱导下海马神经元钠通道斜坡电流的第二个峰的电 流幅度只与跨膜电位相关。毒素对通道斜坡电流的影响强烈提示毒 素处理使神经元自发性爆发动作电位。电流钳实验证实RTX—VII诱 导海马神经元静息状态下爆发动作电位导致中枢神经系统的兴奋性 中毒。 NeL 1．3全部四个结构域的电压敏感元件和孔道区替换成Na，1．5通道 的相应区域，我们研究了Na，1．3通道各结构域在晚期钠电流产生中 的作用。Na，1．3通道的第二结构域和第四结构域孔道区的替换显著 降低通道在毒素诱导下产生的稳态晚期钠电流，但不影响毒素对通 道的表观亲和力。Na,1．3通道第四结构域电压敏感元件的替换显著 改变毒素对通道的结合，Na，1．3通道第一结构域孔道区的替换不影 响通道在毒素诱导下产生的稳态晚期钠电流幅度但较小程度的改变 道上的神经毒素作用位点4，对位点3进行单点突变扫描证实该区域 的多个氨基酸残基参与毒素的结合。 将Na，1．3通道的四个结