酶的定向进化创新.pptVIP

酶法体外随机-定位诱变 　　为解决空间结构未知酶的蛋白质工程问题, 我们曾以类胰岛素样人参多肽基因和天冬氨酸酶基因为模型, 探索了一种酶体外诱变的新途径, 即酶法体外随机-定位诱变(random-site-directed mutagenesis)〔29～32〕.　该方法的内涵与酶的体外定向进化类似, 对目的基因既采用随机突变增加突变位点, 以快速产生优质酶,又让其突变受到一定限制, 以减少筛选突变体的工作量. 实际上, 该法也是体外模拟自然进化. 不同点在于，通过控制DNA合成的底物种类和浓度比例实现碱基对的错配.　　从上述策略不难看出,随着分子生物学技术的发展, 可以更灵活、快速和简便地改造目的基因. 从功能出发, 先获得某优化的突变体, 一方面可快速将其推向应用, 另一方面将对蛋白质的理论研究起到更大的推动作用. 定向进化的筛选策略 琼脂板涂布法 在特殊条件下培养突变菌，通过宿主菌的生长情况、培养基颜色、特定反应的出现等判断是否具有目的基因。 微孔板悬浮法 在含生色底物平板上培养，挑取具有活性的克隆接种到96孔板上检测吸光度。使用微流控芯片。 微球细胞固定法 与数字成像系统结合，将单个细胞附着在单个固体珠上，突变体进行分离和筛选。 流式细胞计数法 细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，排成单行，逐个通过流式细胞计数仪进行测定。 突变体分离 通过酶促反应的